基于免疫相關細胞因子研究理沖湯對子宮肌瘤細胞凋亡和增殖的影響

李冬華 劉 宇 王文娜

(首都醫科大學中醫藥學院，北京，100069)

子宮肌瘤(Uterine Fibroid)是女性生殖系統最常見的良性腫瘤，育齡人群發病率高達70%[1-2]。因其可導致月經量增多、痛經甚至不孕等問題，嚴重影響女性的身心健康[3-4]，故一直備受學界重視。目前子宮肌瘤的病因尚不完全明確。子宮肌瘤不僅病程較長，而且會伴隨諸多的臨床癥狀。對于體積較大的肌瘤，臨床上通常采用子宮切除術的終極治療手段，但對于要求保留子宮的肌瘤患者來說這樣的手術方法往往難以接受。雖然有肌瘤剔除術可供選擇，但其存在較高的術后復發風險[5]，也不是理想的解決方案。現代醫學主要使用激素類藥物，如促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing Hormone，GnRH)激動劑、米非司酮等，雖然臨床療效明確，但嚴重的不良反應及潛在的致癌風險限制了其長期使用，而且還存在著停藥后極易復發等問題[6-7]。目前子宮肌瘤尚缺少理想的治療藥物，因此臨床上仍存在部分患者的治療需求無法得到滿足的問題。

理沖湯是治療子宮肌瘤的中醫經典名方，大量臨床實踐證實該方可明顯縮小肌瘤體積，顯著改善臨床癥狀，對子宮肌瘤具有較為理想的療效。前期研究表明理沖湯可抑制腫瘤新生血管生成、阻礙細胞外基質降解以及抑制腫瘤免疫逃逸[8-10]，提示理沖湯對子宮肌瘤微環境具有改善作用。但是理沖湯調控免疫應答抗子宮肌瘤的作用機制還不是十分清楚，目前仍存留著諸多科學問題值得被人們深入研究。因此，本研究通過透射電子顯微鏡觀察細胞超微結構，采用免疫組織化學染色檢測胱天蛋白酶-3、Ki67的表達情況，以及使用MSD電化學發光技術檢測白細胞介素-12p70(Interleukin-12p70，IL-12p70)、IL-1β、IL-6、生長相關癌基因/角質形成細胞趨化蛋白(Growth-related Oncogene/Keratinocyte Chemoattractant，GRO/KC)的表達水平，研究理沖湯調控免疫相關細胞因子，促進子宮肌瘤細胞凋亡、抑制細胞增殖的作用機制，為理沖湯的臨床應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 CB-17 Scid小鼠[北京維通利華實驗動物科技有限公司，SCXK(京)2016-0001]，雌性，未孕，6～9周齡，共24只，飼養于首都醫科大學實驗動物部，溫度為25～27 ℃，恒濕為45%～50%，飼養環境為無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級。本研究通過倫理委員會審批(倫理審批號：AEEI-2017-115)。

1.1.2 藥物 理沖湯的藥物組成為生黃芪9 g、黨參6 g、白術6 g、生山藥15 g、天花粉12 g、知母12 g、三棱9 g、莪術9 g、生雞內金9 g，上述藥物均購自北京同仁堂飲片有限責任公司。制備工藝如下，飲片水提2次，煎煮1 h/次，首次加入飲片的8倍量水，第2次加6倍量水，煎成之時，加少許好醋。合并2次煎液，溫度為60 ℃，壓力為0.05 kPa的條件下過濾減壓，濃縮至浸膏(相對密度為1.3)。最終配置成含生藥1.7 g/mL的濃縮液，-4 ℃低溫保存。

米非司酮(北京紫竹藥業有限公司，批號：43110911)，用0.5%羧甲基纖維素鈉(Sigma公司，美國，批號：C5678)配制成懸液，濃度為0.7 mg/mL。黃體酮注射液(上海通用公司，批號：130905)；苯甲酸雌二醇注射液(天津金耀氨基酸公司，批號：0703121)；堿性成纖維細胞生長因子(Signalway Antibody公司，美國，批號：70402)；表皮生長因子(Signalway Antibody公司，美國，批號：70504)。

1.1.3 試劑與儀器 MSD試劑盒(上海優寧維生物科技股份有限公司，批號：K15048D-1)；光學顯微鏡(Olympus公司，日本，型號：CX31)；MSD超敏因子電化學發光分析儀(MSD公司，美國，型號：Quick-Plex SQ120)。

1.2 方法

1.2.1 分組和異種移植小鼠子宮肌瘤模型的建立 將24只小鼠采用隨機數字法分為正常組、模型組、理沖湯組和陽性藥組，每組6只。人子宮肌瘤樣本來源于首都醫科大學附屬北京婦產醫院因患子宮肌瘤行全子宮切除術者，確保患者至少在術前3個月未接受過其他藥物治療，實驗樣本通過組織病理學證實。取子宮肌瘤組織1 cm3左右，迅速置于磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)(含3%青鏈霉素)中，封閉冰浴轉移至細胞間。把組織塊盡可能切成糜狀，Ⅰ型膠原酶消化約2 h，使用70 μm細胞篩收集細胞。細胞在20%胎牛血清培養液中培養，傳至2～3代時將細胞濃度調整為1.5×106個/mL用于細胞異種移植手術。除正常組外，其他小鼠腹腔注射雌、孕激素7 d以促進子宮發育。使用戊巴比妥鈉麻醉小鼠，剖腹探查術剝離Y形子宮，在子宮左側分角處注入表皮生長因子(0.5 ng/mL)和堿性成纖維細胞生長因子(2 ng/mL)。注射器吸取100 μL子宮肌瘤細胞懸液，并與伊文思藍混合(使注射位點可視化)后注入小鼠子宮右側分角處，操作結束后逐層縫合腹膜切口。28 d后各組選取1只小鼠進行子宮病理學鑒定，當平滑肌有明顯紊亂或增厚，視為模型制備成功。

1.2.2 藥物干預 理沖湯組每日灌服理沖湯濃縮液(30 g/kg)。陽性藥組每日灌服米非司酮懸液(2.9 mg/kg)。正常組和模型組每日灌以等量的0.9%氯化鈉溶液。連續藥物干預28 d。

1.2.3 檢測方法 透射電子顯微鏡：切取子宮組織1 mm3，戊二醛固定液固定24 h。PBS沖洗3次，加入1%鋨酸，靜置處理1 h。4 ℃環境下進行乙醇梯度脫水3次，之后按1∶1比例配制90%乙醇和90%丙酮混合溶液再次脫水，最后于室溫環境下100%丙酮中脫水。將組織樣品逐梯度滲透，使包埋劑浸入組織細胞內，之后烘箱進行固化。采用超薄切片機將組織塊切片，切片面積控制在0.5 mm×0.3 mm之內，厚度為10～100 μm。檸檬酸鉛和醋酸雙氧鈾染色后，切片移至電鏡下進行觀察。

免疫組織化學染色：使用多聚甲醛固定子宮肌瘤組織，常規浸蠟、包埋，切成厚度約為5 μm的組織切片。切片常規脫蠟后進行抗原修復，再浸泡在3% H2O2溶液中，室溫避光25 min。10%正常兔血清封閉后，加入一抗，濕盒內4 ℃孵育過夜。次日加入二抗室溫孵育50 min。DAB顯色和細胞核復染，中性樹膠封片。鏡下觀察拍照，ImageJ軟件對圖片進行統計處理。

MSD電化學發光技術：將配置完成的標準品復溶室溫平衡15 min，渦旋震蕩，標準品原液4倍稀釋，樣本和質控品稀釋2倍。用200 μL洗滌液反復清洗MSD板3次，每孔加入50 μL樣品，室溫下孵育2 h，每孔中25 μL檢測抗體，室溫孵育2 h，之后加入150 μL的讀板液，使用MSD設備讀板分析。

2 結果

2.1 采用透射電鏡觀察子宮平滑肌細胞的超微結構 正常組的子宮平滑肌細胞呈長梭形，排列整齊，相鄰細胞體積一致，細胞膜結構完整。細胞核明顯，核仁位于中央，無腫大或固縮。胞質內各細胞器數量、結構均正常；模型組的子宮平滑肌細胞肥大，細胞間隙增寬，排列不規則，細胞周圍存在大量纖維結締組織。細胞膜增厚、缺損，界限不清。細胞核有明顯皺縮，核仁模糊不清甚至消失。細胞器均有不同程度的腫大變形，可見線粒體基質變淺，嵴變短，粗面內質網擴張，內部形成空泡；理沖湯組的子宮平滑肌細胞形態正常，排列有序，細胞膜結構完整，僅有少量胞膜增厚。細胞核清晰，呈輕度固縮，核仁無異常。線粒體與粗面內質網數量較模型組明顯減少，部分輕微腫大；陽性藥組的子宮平滑肌細胞排列紊亂程度較模型組顯著減輕，但細胞間隙寬窄不等，其間可見少量纖維結締組織。細胞膜大體完整，個別部位有破損，胞膜增厚不明顯。細胞核結構清晰，核膜完整，核仁位于中央，略有皺縮。少量發達的線粒體圍繞于胞核周圍，粗面內質網腫脹不明顯。見圖1。

圖1 子宮平滑肌細胞的超微結構(×8 000)

2.2 采用免疫組織化學染色檢測胱天蛋白酶-3、Ki67的表達情況 與正常組比較，模型組胱天蛋白酶-3表達明顯降低，Ki67的陽性率明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，理沖湯組和陽性藥組的胱天蛋白酶-3的表達明顯升高，Ki67的陽性率明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 子宮組織中胱天蛋白酶-3、Ki67表達情況

胱天蛋白酶-3主要表達于細胞質中，表達胱天蛋白酶-3的細胞被染成棕黃色。Ki67主要表達于細胞核中，表達Ki67的細胞核被染成紅色。由此可看出較之于正常組，模型組中的平滑肌細胞和腺體細胞中Ki67的表達較為豐富，胱天蛋白酶-3的表達較少，而理沖湯組和陽性藥組中Ki67的表達較少，但胱天蛋白酶-3的表達增多。見圖2、3。

圖2 4組胱天蛋白酶-3的表達情況(免疫組織化學染色，×200)

圖3 4組Ki67的表達情況(免疫組織化學染色，×200)

2.3 4組IL-12p70、IL-1β、IL-6、GRO/KC的表達情況 與正常組比較，模型組IL-12p70的表達水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，理沖湯組IL-12p70的表達量明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，陽性藥組IL-12p70表達升高，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

與正常組比較，模型組IL-1β、IL-6、GRO/KC的表達水平明顯升高(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，理沖湯組的IL-1β、IL-6、GRO/KC的表達明顯降低(P<0.05，P<0.01)，陽性藥組僅IL-6表達明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，IL-1β、GRO/KC變化差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 子宮組織中IL-12p70、IL-1β、IL-6、GRO/KC表達情況

3 討論

腫瘤的發病和人體自身免疫應答異常有著非常緊密的關系。現代免疫編輯理論認為，腫瘤的發生發展在患者體內要經歷3個階段：清除、平衡、逃逸[11]。早期新生腫瘤細胞具有較強的抗原性，易被免疫系統識別并清除。如果此時腫瘤細胞逃脫免疫系統的“清除”功能，即會進入“平衡”狀態，此階段腫瘤細胞的抗原性減弱，不易被免疫系統識別和清除。當這種“積累效應”達到一定程度時，就會打破平衡，最終實現免疫逃逸，形成實體腫瘤[12]。腫瘤發生的實質即是機體抗腫瘤免疫系統逐漸步入劣勢，腫瘤細胞逐漸趨于強勢的過程。

在子宮肌瘤形成的過程中，免疫微環境內的不同細胞因子發揮了不同作用。IL-12p70是抗腫瘤免疫應答反應中的重要細胞因子。目前有研究證實，IL-12p70可以增強CD8+T淋巴細胞、自然殺傷細胞、巨噬細胞對腫瘤的殺傷作用[13]。同時，IL-12p70還可以誘導免疫淋巴細胞產生γ干擾素，進而改變腫瘤細胞增殖周期，促進腫瘤細胞發生凋亡[14]。IL-1β與腫瘤的增殖、分化及侵襲過程密切相關。IL-1β在產生生物活性前，需要經過胱天蛋白酶-1的剪切加工，IL-1β成為成熟體后可以介導血管內皮生長因子(Vascular Endothelial Cell Growth Factor，VEGF)的生成，進而誘導腫瘤新生血管的形成，促進腫瘤生長[15]。IL-6主要通過JAK激酶2(Janus Kinase 2，JAK2)以及信號轉導及轉錄激活因子3(Signal Transduction and Activator of Transcription 3，STAT3)信號通路促進局部炎癥反應的發生，誘導腫瘤細胞的增殖和侵襲。腫瘤細胞同樣通過STAT3信號通路促進IL-6的分泌[16]。腫瘤生長相關基因(Growth Related Oncogene)GRO/KC是ELR-CXC趨化因子家族中的一員，GRO與受體CXCR2結合可誘發多種生理效應，如炎癥反應、病毒感染等[17]。近年來發現，GRO在肺癌、胃癌、膀胱癌等癌癥中呈高表達狀態，后續研究也證實GRO與腫瘤的增殖、侵襲等過程具有一定相關性[18]。胱天蛋白酶-3是細胞凋亡通路下游的關鍵蛋白，其表達水平反映了細胞的凋亡程度。通常胱天蛋白酶-3在細胞質中處于無活性狀態，凋亡程序啟動時胱天蛋白酶-3被激活，并對局部結構蛋白進行切割，最終引起細胞凋亡[19]。抑制細胞增殖因子Ki67分布于細胞核內，其活性與細胞增殖過程密切相關，是衡量細胞增殖水平的標志物，也是評估腫瘤預后的重要指標[20]。

理沖湯是治療正虛血瘀型子宮肌瘤的中醫經典名方，出自張錫純所著醫書《醫學衷中參西錄》，用來治療“婦女閉經不行或產后惡露不盡，……治一切臟腑癥瘕、積聚、氣郁、脾弱、滿悶、痞脹、不能飲食”。該方具有扶正祛瘀之功效，為消補兼施的良方。方中黃芪與黨參為君藥，用以扶正祛邪、益氣活血，使瘀血去，新血生；三棱與莪術為臣藥，以活血祛瘀；白術、山藥、知母、天花粉共為佐藥，其中白術、山藥補氣健脾，助參芪扶正，防化瘀太過傷氣，知母、天花粉涼潤解毒，可制參芪之熱，又可滋腎水之枯；生雞內金為使藥，消積散結而不傷正。理沖湯配伍嚴謹，用藥精當，攻補兼施，體現了扶正祛邪兼顧，消癥瘕而不傷正，益氣血而不留瘀的特點。因此，理沖湯被廣泛應用于治療正虛血瘀之婦科癥瘕，十分契合子宮肌瘤的中醫病機。

本研究結果顯示，理沖湯能夠改善子宮組織的細胞超微結構，促進細胞凋亡因子胱天蛋白酶-3的表達，抑制細胞增殖因子Ki67的表達，同時促進IL-12p70，抑制IL-1β、IL-6、GRO/KC的表達，說明理中湯可以通過調控免疫相關細胞因子的表達水平進而促進子宮肌瘤細胞凋亡、抑制其細胞增殖，達到抑制子宮肌瘤的目的。

中醫藥治療子宮肌瘤具有突出優勢，但基礎研究較為薄弱，存在著物質基礎及藥理作用機制不明確等問題，一定程度上阻礙了中醫藥進一步邁向科學化和國際化的進程。本研究闡釋了理沖湯在免疫調控方面的部分作用機制，旨在為理沖湯的臨床應用提供理論依據，為中醫藥事業的發展做出積極貢獻。