二仙湯治療早發(fā)性卵巢功能不全的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

李 敏 郭 淼 孫建華 翟鳳霞 李 娜

(1 河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州，450046；2 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，鄭州，450000)

早發(fā)性卵巢功能不全(Premature Ovarian Failure，POI)是指40歲之前的女性因卵巢功能減退而出現(xiàn)的一系列臨床綜合征，影響女性生育力及身心健康，其臨床患病率為1%～3%[1]。目前，激素補(bǔ)充是西醫(yī)臨床主要治療方案，即單純雌激素治療，雌孕激素序貫或連續(xù)聯(lián)合治療和陰道局部應(yīng)用雌激素治療[2]。這些治療方案對(duì)調(diào)整月經(jīng)周期，改善低雌激素狀態(tài)，緩解并發(fā)癥狀具有一定的治療作用，但在臨床應(yīng)用存在一定的禁忌證及潛在的血栓、腫瘤等風(fēng)險(xiǎn)[3]。

現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)家普遍認(rèn)為該病虛實(shí)夾雜，但總以腎氣虧損為基本病機(jī)。因此當(dāng)以滋補(bǔ)腎氣為主要治療原則。二仙湯是第六批全國(guó)名老中醫(yī)藥專(zhuān)家王麗娜教授治療POI的常用方，該方具有溫腎陽(yáng)，補(bǔ)腎精，交通心腎，調(diào)理沖任的功效。二仙湯聯(lián)合西藥治療POI相較于單純西藥，在療效及安全性方面，具有明顯的優(yōu)越性[4]。現(xiàn)代藥理研究顯示，二仙湯能夠發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞增殖的作用[5-6]。

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的技術(shù)支持[7]，本研究旨在活性成分、核心作用靶基因及信號(hào)通路方面，系統(tǒng)闡釋二仙湯作用于POI的作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究做準(zhǔn)備。

1 資料與方法

1.1 篩選、獲取二仙湯活性成分和靶基因 本研究借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmsp.php),以藥物口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%、類(lèi)藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18為條件，篩選二仙湯的6味藥物仙茅、淫羊藿、巴戟天、黃柏、知母、當(dāng)歸的活性成分[8]。并在該數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢藥物活性成分所對(duì)應(yīng)的靶基因，建立藥物靶基因數(shù)據(jù)集。

1.2 查詢、收集疾病靶基因 將POI的英文名稱(chēng)“Premature Ovarian Insufficiency”分別輸入在線人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，http://www.omim.org)及GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.genecards.org/)進(jìn)行查詢，以獲得POI相關(guān)的疾病靶基因，建立疾病靶基因數(shù)據(jù)集。

1.3 構(gòu)建藥物活性成分與作用靶基因的網(wǎng)絡(luò) 利用ClusterProfiler軟件包進(jìn)行韋恩分析，取疾病靶基因與藥物活性成分靶基因的交集，建立疾病-藥物數(shù)據(jù)集，將該數(shù)據(jù)集與活性成分?jǐn)?shù)據(jù)集共同導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，繪制藥物活性成分與作用靶基因網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)行可視化。

1.4 預(yù)測(cè)二仙湯作用于POI的核心靶基因 將交集靶基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得二仙湯活性成分靶基因和POI相關(guān)靶基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并篩選出核心靶基因。

1.5 二仙湯治療POI的生物學(xué)過(guò)程與通路分析 采用ClusterProfiler軟件包對(duì)作用靶基因先后進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)分析，并繪制通路圖，進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 二仙湯的活性成分篩選 得出92個(gè)活性成分，并將其作為候選化合物。這些成分相對(duì)應(yīng)靶基因205個(gè)，整理活性成分靶基因數(shù)據(jù)集。

2.2 疾病靶基因篩選 通過(guò)OMIM、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)分別收集到靶基因392個(gè)、3 032個(gè)，去重后共計(jì)3 425個(gè)，整理為疾病靶基因數(shù)據(jù)集。

2.3 藥物活性成分-作用靶基因網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建與分析 由圖1可知，有173交集靶基因，即為二仙湯治療POI的作用靶基因。圖2包括239個(gè)節(jié)點(diǎn)，代表藥物活性成分和作用靶基因，1 153條邊。二仙湯的主要活性成分為Stigmasterol(豆甾醇)、Kaempferol(山柰酚)、Beta-Sitosterol(Β-谷甾醇)、Luteolin(木犀草素)、Anhydroicaritin(淫羊藿苷元)、Quercetin(槲皮苷)等。

圖1 二仙湯-POI靶基因韋恩圖

圖2 藥物活性成分-作用靶基因網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 二仙湯對(duì)POI核心靶基因的預(yù)測(cè) 結(jié)果顯示：Degree值最大是36，最小是1。其中排名前4的基因是AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT1)、促分裂原活化的蛋白激酶1(MAPK1)、活化蛋白(AP)-1轉(zhuǎn)錄因子亞單位(JUN)、核因子κB/p65(RELA)。見(jiàn)圖3。

圖3 二仙湯與POI的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 二仙湯治療POI核心靶基因GO富集分析 生物過(guò)程(Biological Process，BP)條目1 939個(gè)，富集基因數(shù)量較大的有對(duì)營(yíng)養(yǎng)水平的反應(yīng)(Response to Nutrient Levels)、氧化應(yīng)激反應(yīng)(Response to Oxidative Stress)、對(duì)金屬離子的響應(yīng)(Response to Metal Ion)、對(duì)脂多糖反應(yīng)(Response to Lipopolysaccharide)、對(duì)細(xì)菌源性分子的反應(yīng)(Response to Molecule of Bacterial Origin)、類(lèi)固醇激素反應(yīng)(Response to Steroid Hormone)等。見(jiàn)圖4。細(xì)胞組分(Cellular Component，CC)條目72個(gè)，富集基因數(shù)量較大的有膜筏(Membrane Raft)、膜微結(jié)構(gòu)域(Membrane Microdomain)、膜區(qū)域(Membrane Region)、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物(Transcription Factor Complex)、神經(jīng)元胞體(Neuronal Cell Body)等。見(jiàn)圖5。分子功能(Molecular Function，MF)條目141個(gè)，富集基因數(shù)量較大的有DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性，RNA聚合酶Ⅱ特異性(DNA-Binding Transcription Activator Activity，RNA Polymerase II-Specific)、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合(Ubiquitin-Like Protein Ligase Binding)、細(xì)胞因子受體結(jié)合(Cytokine Receptor Binding)、受體配體活性(Receptor Ligand Activity)等。見(jiàn)圖6。KEGG通路富集篩選得到164條信號(hào)通路，根據(jù)富集基因數(shù)量進(jìn)行排序，選擇前20個(gè)通路進(jìn)行柱狀圖展示，其基因靶基因主要富集于Toll樣受體信號(hào)通路(Toll-Like Receptor Signaling Pathway)、腫瘤壞死因子信號(hào)通路(TNF Signaling Pathway)、低氧因子信號(hào)通路(HIF-1 Signaling Pathway)、T細(xì)胞受體信號(hào)通路(T Cell Receptor Signaling Pathway)等相關(guān)信號(hào)通路。

圖4 作用靶基因的GO-BP分析氣泡圖(前20條)

圖5 作用靶基因的GO-CC分析氣泡圖(前20條)

圖6 作用靶基因的GO-MF分析氣泡圖(前20條)

2.6 二仙湯治療POI信號(hào)通路的KEGG富集分析 圖7X軸代表富集在信號(hào)通路上的基因數(shù)目，顏色代表富集的相關(guān)性。由圖可知，主要涉及PI3K-AKT Signaling Pathway、MAPK Signaling Pathway、TNF Signaling Pathway等信號(hào)通路。

圖7 作用靶基因的KEGG分析柱狀圖(前20條)

3 討論

二仙湯通過(guò)包括槲皮苷、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇、木犀草素等在內(nèi)的66個(gè)有效成分作用于POI。槲皮苷是一種能促進(jìn)卵泡發(fā)育和卵巢顆粒細(xì)胞增殖的黃酮類(lèi)化合物，可促使雌激素分泌，以改善雷公藤多苷致POF動(dòng)物模型的卵巢功能[9]。山柰酚也是在植物中提取的黃酮類(lèi)化合物。有研究發(fā)現(xiàn)山柰酚可通過(guò)下調(diào)Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(Notch Intracellular Domain，NICD)mRNA的表達(dá)，降低Notch1蛋白的表達(dá)而發(fā)揮抑制卵巢細(xì)胞SKOV-3細(xì)胞增殖，從而誘導(dǎo)其凋亡的作用[10]。曾莉萍等[11]研究觀察到β-谷甾醇具有雌激素活性，具有誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞分化，促進(jìn)雌激素合成的作用。豆甾醇與β-谷甾醇同為植物甾醇類(lèi)雌激素，具有降低血清中膽固醇水平的功能[12]，改善低雌激素水平下的心腦血管的功能。木犀草素在卵巢顆粒細(xì)胞的體外培養(yǎng)中，當(dāng)其濃度達(dá)到12.5 μg/mL時(shí)，能促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞分泌雌激素[13]。

根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)可知，二仙湯治療POI可能主要通過(guò)作用MAPK1、AKT1、JUN、RELA等靶標(biāo)來(lái)發(fā)揮作用。細(xì)胞外因子激活MAPK，由此可將信號(hào)由細(xì)胞表面?zhèn)魉椭良?xì)胞核內(nèi)部。MAPK1基因蛋白在卵巢發(fā)育后期的前期卵巢中的表達(dá)明顯增強(qiáng)，在卵母細(xì)胞及卵巢的發(fā)育和成熟過(guò)程中該基因可能起重要作用[14]。AKT1參與增殖、存活、生長(zhǎng)等多種生物學(xué)過(guò)程。活化的蛋白激酶B可激發(fā)下游的叉頭盒O類(lèi)1A(Forkhead Box，Class O，1A，F(xiàn)oxo1a)mRNA的表達(dá)，從而影響卵巢顆粒細(xì)胞的增殖[15]。活化蛋白-1是有堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的JUN蛋白，在不同疾病中表現(xiàn)出上調(diào)或下調(diào)的表達(dá)。作為核因子κB家族的重要成員之一，RELA通過(guò)對(duì)靶的調(diào)節(jié)，發(fā)揮在顆粒細(xì)胞的增殖、凋亡、免疫應(yīng)答等過(guò)程中相關(guān)作用[16]。

KEGG分析結(jié)果顯示，二仙湯通過(guò)PI3K-AKT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等作用于POI。PI3K-AKT信號(hào)通路參與原始卵泡的發(fā)育、顆粒細(xì)胞的增殖和分化等生物過(guò)程[17]。促卵泡素促進(jìn)顆粒細(xì)胞中蛋白激酶B的磷酸化，并通過(guò)PI3K-AKT信號(hào)通路抑制顆粒細(xì)胞凋亡[18]。MAPK信號(hào)通路對(duì)卵巢的顆粒細(xì)胞增殖發(fā)揮促進(jìn)或抑制雙面作用，即，各種因子可通過(guò)MAPK信號(hào)通路能夠發(fā)揮對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞上調(diào)、下調(diào)的作用[19]。國(guó)內(nèi)回顧性研究發(fā)現(xiàn)POI患者血清中TNF-α水平低于正常水平，而在POI的發(fā)病過(guò)程中，TNF-α起著重要作用[20]。研究發(fā)現(xiàn)，加入TNF-α的卵泡內(nèi)膜細(xì)胞,表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞增殖能力,即TNF-α能促進(jìn)卵泡膜細(xì)胞增殖[21]。

綜上所述，就活性成分、靶基因、信號(hào)通路三方面而言，二仙湯治療POI是具有多途徑的，這為之后開(kāi)展動(dòng)物與臨床試驗(yàn)研究，提供一定的依據(jù)。