KRAS基因突變對經肝動脈化療栓塞術治療的中晚期原發性肝癌患者預后的預測價值

劉旭初，覃世運，陳麗君，陳 娟，尤曉光

1 海南省第三人民醫院(三亞中心醫院)a.腫瘤治療中心, b.藥學部，海南 三亞 572000；2 海南醫學院第一附屬醫院 放射科，海口 570102

原發性肝癌作為臨床最為常見的惡性腫瘤之一，具有較高的發病率和死亡率，是最為常見的癌癥相關性死亡原因之一[1-2]。由于原發性肝癌發病隱匿，患者缺乏早期典型的臨床癥狀，大部分患者在臨床確診時已經處于疾病的中晚期階段，能夠進行根治性手術切除的患者比例甚至不足20%。經肝動脈化療栓塞術(transcatheter arterial chemoembolization, TACE)是中晚期原發性肝癌患者治療的主要手段，可有效改善患者臨床預后[3-5]。然而，當前仍缺乏評價中晚期肝癌TACE術后預后的有效方式。研究[6-7]顯示，表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)信號通路是原發性肝癌發生發展的關鍵。KRAS基因屬于Ras原癌基因家族中的一員，不僅是抗EGFR靶向治療選擇的重要依據，同時也可能成為患者預后的預測因子。本研究探討KRAS基因狀態對TACE治療中晚期肝癌患者預后的預測價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2017年4月—2020年5月在海南省第三人民醫院接受TACE治療的中晚期肝癌患者為研究對象。納入標準：(1)患者均經穿刺活檢，臨床病理診斷為原發性肝癌患者；(2)心、肺、腎等機體主要器官功能無明顯障礙患者；(3)巴塞羅那肝癌臨床分期(BCLC)B期或C期患者；(4)肝功能Child-Pugh分級為A級或B級患者；(5)無法接受外科手術治療切除患者；(6)卡氏(KPS)評分>60分；(7)術前未接受其他治療。排除標準：(1)合并嚴重凝血功能障礙患者；(2)大量腹水或頑固性腹水患者；(3)有TACE治療禁忌證患者；(4)合并遠處轉移患者。

1.2 TACE治療方法 使用Seldinger法穿刺患者股動脈，插管直至肝總動脈進行造影，以明確腫瘤大小、數目、位置。以微導管超選擇插管至支配肝癌病灶的主要供血動脈內，將化療藥物(氟尿嘧啶750 mg/m2，奧沙利鉑60 mg/m2)稀釋液緩慢注入，然后使用15～25 mL 40%碘化油栓塞腫瘤末梢血管。若有必要可使用明膠海綿顆粒，以盡可能完全阻斷患者腫瘤血供。根據患者腫瘤大小、數量以及患者肝功能具體情況確定碘化油及栓塞劑的使用劑量。此外，根據患者情況決定TACE治療次數，本研究患者治療2～3次。

1.3 KRAS基因檢測 TACE手術前，在超聲引導下對肝癌組織進行穿刺取材，取5 g左右腫瘤組織，按照QIAamp DNAFFPF Kit試劑盒(Qiagen公司)步驟提取腫瘤組織DNA，使用紫外分光光度計檢測提取DNA濃度，然后調節濃度至100 μg/mL，-20 ℃保存待測。擴增KRAS基因12/13號密碼子特需特異性引物，根據文獻[8]報道，引物序列，正義：5′-CTGTATCAAAGAATGGTCCTGCAC-3′，反義：5′-CTGTATCAAAGAATGGTCCTGCAC-3′。引物及Premix PCR試劑盒購于寶生物工程(大連)有限公司，PCR反應體系50 μL。PCR反應條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、70 ℃ 40 s，共完成30個循環，使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物，選取PCR陽性凝膠條帶作為目的片段，使用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen公司)對PCR產物回收，然后送至上海基因技術有限公司進行測序分析。

1.4 隨訪 所有患者在接受TACE術后，每月復查肝功能、AFP、肝臟增強CT或MRI，以評估患者腫瘤控制情況以及術后復發情況，記錄患者無進展生存期(PFS)以及總體生存期(OS)。PFS指的是從患者TACE術后到觀察到疾病進展或發生死亡(由于任何原因)之間的時間；OS指的是從患者TACE術后到患者死亡(由于任何原因)之間的時間。

2 結果

2.1 KRAS基因突變檢測結果 97例患者中男61例、女36例，年齡30～78歲，平均(56.48±12.31)歲。腫瘤最大徑2.89～9.74 cm，平均(7.19±2.08)cm；腫瘤單個89例、≥2個18例。在本組97例晚期肝癌患者中，共檢出KRAS基因突變患者34例(35.05%)，其中檢出12號密碼子突變患者21例(61.76%)，13號密碼子突變患者13例(38.24%)。在檢出KRAS基因突變患者中，均為單個堿基的點突變，而并未檢出兩個或兩個以上堿基突變或其他形式的突變(圖1)。

注：a,KRAS基因12、13密碼子野生型基因序列；b,KRAS基因12密碼子GGT→GAT突變；c,KRAS基因12密碼子GGT→GTT突變；d,KRAS基因13密碼子GGC→GAC突變。

2.2 KRAS基因突變狀態與患者臨床病理特征的關系 KRAS基因突變型與野生型比較，肝內轉移、腫瘤數目的差異均有統計學意義(χ2值分別為3.965、6.593，P值均<0.05)(表1)。

表1 KRAS基因突變狀態與患者臨床特征的關系

2.3 KRAS基因突變狀態與患者生存分析 對本組97例患者進行追蹤隨訪顯示，KRAS基因野生型患者平均PFS為11.35個月，突變型患者平均PFS為19.65個月；KRAS基因野生型患者平均OS為19.18個月，突變型患者平均OS為26.54個月。Kaplan-Meier生存分析結果顯示，KRAS基因野生型患者PFS及OS均顯著優于KRAS突變型(P值均<0.05)(圖2、3)。

圖2 KRAS基因狀態與患者PFS的關系

2.4 影響患者預后的Cox分析 對可能影響患者總體生存預后的各因素進行Cox分析，結果顯示，KRAS基因狀態(RR=18.273,95%CI：5.584～98.305)、肝內轉移(RR=11.475,95%CI：3.029～56.490)、腫瘤數目(RR=10.038,95%CI：2.973～19.328)、BCLC分期(RR=12.384,95%CI：2.385～29.305)與患者預后密切相關，為影響患者總體生存預后的重要因素(P值均<0.05)(表2)。

表2 影響患者預后的Cox分析

圖3 KRAS基因狀態與患者OS的關系

3 討論

目前，TACE已經成為無法外科切除中晚期肝癌患者的首選治療方式。肝癌的主要供血為肝動脈供血。經肝動脈碘油注射后，碘油可在肝癌的組織間隙、肝竇以及細小血管內選擇性停滯，從而導致癌細胞失去血液供應而導致腫瘤組織缺血壞死[9-10]；在碘油中混合化療藥物，從而使化療藥物在腫瘤組織中緩慢釋放，延長了化療藥物與腫瘤細胞之間的接觸時間，進而顯著提高化療藥物治療效果，同時可顯著減小化療藥物對患者全身的不良影響，并阻斷腫瘤血供，引起腫瘤組織發生缺血性壞死，進一步增加抗腫瘤療效[11-12]。研究提出[13-14]，采取非手術多模式治療，尤其對于原發性肝癌患者采取TACE治療，可有效延長患者生存期，在中晚期肝癌的治療中具有重要作用。

原發性肝癌是多基因、多分子、多通路間相互作用的結果，因此檢測原發性肝癌患者基因突變狀況，對于患者治療反應以及生存預后具有預測價值，從而有助于實現精準化治療的目的[15-16]。KARS基因突變在原發性肝癌患者中具有著較高的發生率。研究[17-18]顯示，原發性肝癌的發生是一種多步驟過程，而在腫瘤惡性發生的整個過程中，均與KRAS基因突變有關。有研究[19-20]認為，KRAS基因突變被認為是原發性肝癌發生的啟動性因子，尤其G-A堿基突變，可能在多種惡性腫瘤發生中具有重要作用。

本研究結果顯示，在本組97例中晚期肝癌患者中，共檢出KRAS基因突變患者34例(35.05%)，其中檢出12號密碼子突變患者21例(61.76%)，13號密碼子突變患者13例(38.24%)，且檢出的患者均為單個堿基突變。本組結果與相關研究報道結果基本一致[21]。KRAS基因突變率接近35%，是一種較為常見的基因突變形式。此外，KRAS基因突變與患者肝硬化、肝內轉移、腫瘤數目有關。提示KRAS基因突變的存在可能與肝癌疾病的發生發展具有一定的內在聯系，從而為KRAS突變可能成為預測患者治療預后的因素提供一定的基礎。

Kaplan-Meier生存分析結果顯示，KRAS基因野生型患者PFS及OS均顯著優于KRAS突變型。表明了KRAS基因狀態與患者TACE術后生存狀況密切相關。KRAS基因野生型患者可受上游EGFR信號通路的調控，而當KRAS基因發生點突變時，導致該基因編碼P21蛋白的空間結構發生了相應的變化，不再受上游EGFR信號的調控。KRAS基因突變亞型不同，可能也會導致該基因的空間構象發生變化，引起相應的調節細胞內信號通路不同，從而影響化療藥物的結合位點，也可能導致患者對化療藥物的敏感性有所差別，進而影響患者預后。

同時，本研究進一步對可能影響患者術后預后的各因素進行Cox回歸分析，結果顯示，KRAS基因狀態、肝內轉移、腫瘤數目、BCLC分期進入回歸模型，為影響患者總體生存預后的重要因素。腫瘤數目、肝內轉移以及BCLC分期均可有效提示原發性肝癌患者自身狀態及腫瘤的進展情況，故而可影響患者預后，而KRAS基因狀態同樣進入了Cox回歸模型，提示KRAS基因狀態也對患者臨床預后有著重要的影響。此外，通過Kaplan-Meier生存分析以及Cox多因素分析，進一步確定了KRAS基因狀態與患者TACE術后預后具有密切關系，可能成為預測患者術后預后的重要因素之一。KRAS基因突變，可能是導致患者術后預后較差的因素，因此關注肝癌TACE患者KRAS基因狀態，對于提前制訂相關治療計劃具有重要價值。

但是由于本研究納入樣本量相對較小，研究結果可能存在一定的偏差，后期研究將進一步擴大研究樣本量，以獲得更為可靠的臨床研究數據。

綜上所述，KRAS基因突變在原發性肝癌中較為常見，與患者TACE術后不良預后密切相關，可成為患者臨床預后監測的潛在指標。

倫理學聲明：本研究方案于2017年1月8日經海南省第三人民醫院倫理委員會審批，批號：倫(審)2017-09，所納入患者均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：劉旭初、覃世運、陳麗君、陳娟、尤曉光負責課題設計，資料分析，撰寫論文；劉旭初負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。