肝纖維化相關信號通路及中藥活性成分靶向調節作用機制

范文艷，郝君玉，陳虹秀，劉光偉

1 河南中醫藥大學 第一臨床醫學院，鄭州 450000；2 河南中醫藥大學第一附屬醫院 脾胃肝膽科，鄭州 450000

肝纖維化是指由各種致病因子所致的肝內彌漫性細胞外基質(extracellular matrix，ECM)過度沉積，最終導致肝臟結構功能紊亂的病理過程[1]。肝星狀細胞(HSC)的激活在肝纖維化過程中起核心作用[2]。當刺激因素持續存在時，肝纖維化進一步可發展為肝硬化，甚至肝癌，因此，逆轉肝纖維化對慢性肝病的預后有重要意義，然而，目前并無特效的治療方法可應用于臨床。祖國傳統醫藥的應用已有數千年的歷史，其成分的復雜性決定了中藥應用的廣泛性，使其作為抗肝纖維化的潛在候選藥物成為可能。信號轉導通路是肝纖維化發生發展的重要分子機制，本文總結了與肝纖維化相關的信號通路，并探討中藥活性成分靶向信號通路的抗肝纖維化機制，以期尋求臨床抗肝纖維化治療的新靶點及候選藥物。

1 肝纖維化相關信號通路

1.1 Wnt/β-catenin信號通路 Wnt/β-catenin通路是一組進化保守的信號通路，對胚胎發生和成體組織內環境穩定至關重要[3]。當細胞接收到Wnt信號時，Wnt在胞膜上與Frizzled和脂蛋白受體相關蛋白5/6結合，使胞漿磷蛋白被激活，活化的胞漿磷蛋白抑制糖原合酶激酶-3，阻止β-catenin的磷酸化與降解，因此，β-catenin在胞漿中積累并被轉移到細胞核中，與轉錄因子T淋巴細胞因子/淋巴增強因子結合，刺激靶基因的表達[4]。Wnt通路參與纖維化的發生發展過程。Jiang等[5]在活化的HSC中發現，Wnt信號通路中的多個配體、受體和調節蛋白以及Wnt靶基因高度上調。而Wnt抑制因子-1可顯著抑制TGFβ1誘導的HSC的活化，下調活化HSC-T6細胞β-catenin的表達，從而延緩肝纖維化的進展[6]。

1.2 TGFβ/Smad信號通路 TGFβ1被認為是一種有效且顯著的纖維化細胞因子，在肝纖維化過程中以自分泌和旁分泌方式調節HSC的功能，而由TGFβ介導Smad通路是肝纖維化的關鍵調節因子[7]。TGFβ信號由一對跨膜絲氨酸-蘇氨酸激酶受體TβRⅠ和TβRⅡ介導，當TGFβ與TβRⅡ結合時，TGFβ信號被啟動，隨后TβRⅡ招募并激活TβRⅠ，使其在羧基末端序列SSXS處磷酸化SMAD蛋白，磷酸化的Smad形成異聚體復合物進入胞核，與靶基因的啟動子或增強子結合，并與轉錄共激活子和共抑制子相互作用，以誘導細胞特異性轉錄程序[8]。當shRNA介導TGFβRⅠ基因敲除時，HSC-T6細胞的激活和增殖受到抑制，纖維化ECM成分的合成/分泌水平降低[9]，表明阻斷TGFβ/Smad信號傳導通路可能成為肝纖維化的治療策略。

1.3 核因子-κB(NF-κB)信號通路 NF-κB是一個二聚體轉錄因子家族，越來越多的證據表明，NF-κB在HSC激活中起作用，表現為靜止的HSC缺乏NF-κB，而激活的HSC表現出與NF-κB調節基因組成性表達相關的NF-κB[10]。標準NF-κB途徑可在各種刺激下激活，包括促炎細胞因子和病原體相關分子模式，其與腫瘤壞死因子受體、Toll樣受體或IL-1受體等不同受體結合，導致IκB激酶復合物激活，催化NF-κB抑制劑(IκB)的磷酸化、多泛素化和降解，隨后NF-κB被釋放并發生核易位，作用于相應的靶基因[11-12]。研究[13]發現，IκB激酶抑制劑柳氮磺胺吡啶干預纖維化大鼠可顯著改善纖維化病理評分，并降低α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、金屬蛋白酶組織抑制劑-1(tissue inhibitors of metallo proteinases-1，TIMP-1)和Ⅰ型膠原的表達。因此，調控NF-κB信號通路可能有益于肝纖維化的治療。

1.4 Hedgehog(Hh)信號通路 Hh蛋白是廣泛存在于多個物種的分泌糖蛋白，Hh信號通路在肝臟炎性及纖維性病變中扮演重要角色。一項針對非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)患者肝活檢的分析結果[14]顯示，肝損傷(即肝細胞氣球樣變、門靜脈炎癥和肝纖維化)的嚴重程度與該疾病中Hh通路的活性水平平行。Hh信號通路通過配體與12通道跨膜蛋白受體Patched1(PTCH1)和Patched2(PTCH2)結合激活細胞內信號級聯，存在于胞漿中的關鍵轉錄因子GLI2和GLI3被激活后轉移到細胞核，誘導Hh靶基因的轉錄[15]。Syn等[16]誘導NAFLD小鼠模型發現，與野生型(WT)小鼠相比，Ptc+/-(Hh信號沉默受損)小鼠表現出持續的Hh靶基因過度誘導和更多的上皮間質轉化、肌成纖維細胞聚集和纖維化。上述研究提示，Hh途徑抑制劑的抑制及Hh靶基因高表達參與了肝纖維化損傷過程。

1.5 其他參與肝纖維化的信號通路 絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，MAPK家族包括4個亞族：ERK、p38、JNK和ERK5，分別介導了不同的信號轉導途徑，被證實在肝纖維化中起促進作用[17]。通過對瘦素的研究[18]發現，ERK途徑、p38途徑和JNK途徑均參與了HSC的活化，是瘦素促肝纖維化的主要分子機制。JAK/STAT通路中的STAT蛋白是多種促纖維化信號的整合因子，STAT基因敲除可抑制成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，并減少膠原生成，表現出有效的抗纖維化作用[19]。PI3K/Akt信號通路也參與了肝纖維化的發病，高活性的磷酯酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)使促纖維化介質增加，包括TGFβ和結締組織生長因子，誘導HSC的活化及ECM的沉積，選擇性抑制PI3K、阻斷下游信號分子則產生與之相反的效果[20]，因此，PI3K/Akt信號通路的激活驅動了肝纖維化進程。

2 中藥活性成分的抗肝纖維化機制

提取于中草藥的某些活性成分如，酚類、萜類、生物堿類、皂苷類、黃酮類和多糖類化合物，通過靶向肝纖維化相關信號通路，產生抗炎、調控HSC活化及凋亡、抑制肝組織膠原沉積的作用，表現出巨大的抗肝纖維化潛力。

2.1 酚類

2.1.1 姜黃素(curcumin，Cur) Cur是一種酚類化合物，主要存在于姜科植物的根莖中[21]，研究[22]表明，Cur可預防服用肝毒素硫代乙酰胺的大鼠發生肝硬化，主要與Cur能減少活性氧、趨化因子和促纖維化分子的產生有關。王國泰等[23]通過體外細胞實驗與動物實驗均證明了Cur能夠顯著抑制HSC纖維相關蛋白的表達，抑制活化狀態下HSC的增殖，且具有劑量依賴性，并發現Cur的抗纖維化作用可能是通過抑制Smad2磷酸化從而阻止其入核，影響TGFβ/Smad2信號通路下游纖維蛋白基因編碼和翻譯實現的。

2.1.2 白藜蘆醇(resveratrol，RSV) RSV是廣泛存在于種子植物中的多酚類化合物，具有多種藥理作用[24]。M1型巨噬細胞通過分泌炎性因子、促纖維化因子等參與肝纖維化進展，RSV通過抑制肝纖維化小鼠M1型巨噬細胞內NF-κB通路的活性，或促進M1型向M2型巨噬細胞極化，來延緩肝纖維化進程[25]。此外，RSV還能夠抑制Hh通路中關鍵轉錄因子(Shh、Smo、Patched、Gli1mRNA)及下游靶基因(CyclinD1、CyclinD2、Bcl-2等)的表達，促進HSC凋亡，抑制上皮細胞間質轉化[26]。這提示RSV主要通過NF-κB及Hh信號通路發揮抗肝纖維化作用。

2.1.3 丹酚酸(salvianolic acid，Sal)A、B Sal A、Sal B主要為唇形科植物丹參的水溶性成分，均有抗肝纖維化的功效。Sal A及Wnt通道阻滯劑均能明顯降低肝組織中α-SMA、TIMP-1、Ⅰ型和Ⅲ型膠原水平，且兩者均使β-catenin表達減少[27]，表明Sal A同Wnt通道阻滯劑具有類似的作用，即通過影響Wnt/β-catenin通路產生抗肝纖維化的效應。在肝纖維化大鼠模型中，Sal A抑制了胞質NF-κB與IκBα解離，阻斷了NF-κB的核轉移及靶基因轉錄，從基因水平上抑制炎癥因子與HSC激活標志物的表達，防止了膠原的增生及沉積[28]。Sal B則能通過上調抗纖維化-腫瘤的pSmad3C表達，抑制促纖維化-腫瘤信號pSmad3L，在肝纖維化-肝癌的漫長進程中起關鍵作用[29]。綜上，Wnt/β-catenin、NF-κB和TGFβ/Smad信號通路是Sal A、Sal B抗肝纖維化的主要作用機制。

2.2 萜類

2.2.1 青蒿琥酯(artesunate，ART) ART是青蒿素的水溶性衍生物，近年來，除抗瘧作用外，ART的抗纖維化作用被廣泛研究[30]。在NAFLD中，ART通過下調肝組織中NF-κB、TNFα的表達而起到抗炎作用，從而減少肝細胞的損傷，改善了肝組織纖維化的病理改變[31]。細胞實驗[32]顯示，ART作用于HSC后，可抑制miR-154對β-catenin的活化作用，抑制β-catenin靶基因轉錄，從而促進HSC凋亡，還可通過抑制ERK信號通路傳導來抑制膠原合成，對血吸蟲性肝纖維化產生保護作用[33]。以上研究提示，ART的抗肝纖維化功效與NF-κB、Wnt/β-catenin及MAPK信號通路密切相關。

2.2.2 熊果酸(ursolic acid，UA) UA是天然五環三萜類化合物，其抗肝纖維化功效主要表現為上調基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)、下調TIMP-1的表達，促進ECM降解，其機制與抑制PI3K/Akt及p38MAPK通路的活化有關[34]。隨后張揚武等[35]發現，UA能使HSC細胞中過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptors-γ，PPARγ)基因和蛋白表達上調，抑制HSC細胞的增殖，且具有劑量-效應關系。PPARγ作為一種配體激活轉錄因子，可阻斷TGFβ1信號，抑制Smad磷酸化及靶基因轉錄，減少ECM合成，UA通過上調PPARγ的表達，阻斷TGFβ1/Smad信號轉導成為其抗纖維化的機制之一。

2.3 生物堿類

2.3.1 川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMPZ) TMPZ的化學名為四甲基吡嗪，主要來源于傘形科植物川芎的根莖、姜科植物郁金的根莖等。研究[36]顯示，20～40 mol/L范圍內的TMPZ可呈濃度依賴性地抑制HSC DNA復制，抑制HSC的活力，使細胞周期阻滯于G0/G1期以抑制HSC的增殖，并通過調控凋亡相關蛋白誘導活化的HSC凋亡。TMPZ還通過下調促炎因子IL-6、IL-1β，上調抗炎因子IL-10的表達，抑制JAK2/STAT3信號通路的激活發揮作用[37]。最新研究[38]表明，TMPZ作用于miR-145靶向抑制Smad3，使肝纖維化小鼠血清中透明質酸、層粘連蛋白含量減少，產生抗肝纖維化效應。

2.3.2 苦參素(oxymatrine，OMT) OMT是從豆科槐屬植物苦參中提取的一種天然生物堿，主要含有氧化苦參堿和少量氧化槐果堿，對肝纖維化有一定的治療效果[39]。氧化苦參堿通過抑制HSC中脂滴降解以提供能量的過程，并上調自噬相關蛋白Atg12、Atg5和LC3-Ⅱ表達水平來促進細胞自噬，減少HSC的活化[40]。鮑磊等[41]使用基質膠誘導靜息態HSC時發現，OMT可抑制高糖環境下HSC的活性，避免HSC二次激活造成的更嚴重的肝損傷及肝纖維化，而這種作用可能是OMT通過調節Wnt/Jnk信號通路實現的。

2.4 皂苷類

2.4.1 薯蕷皂苷(dioscin，DIO) DIO是存在于薯蕷科植物中的甾體皂苷元，研究[42]表明，DIO可抑制p38MAPK的磷酸化，抑制膽管結扎(BDL)和二甲基亞硝胺大鼠模型肝組織中HSC的激活，降低Ⅰ型、Ⅲ型膠原α1、α-SMA和纖維連接蛋白的水平，減輕肝纖維化程度。盧世云等[43]在DIO干預CCl4誘導肝纖維化小鼠模型中復制了這一發現，但有趣的是，PI3K、Akt蛋白的表達在DIO干預后顯著降低，表明PI3K/Akt通路也參與其中。因此，DIO可能通過p38MAPK與PI3K/Akt兩條信號通路發揮抗纖維化作用。

2.4.2 三七總皂苷(panax notoginseng saponins，PNS) PNS是從中藥三七中提取的有效成分，包含多種單體皂苷，如：人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1等。PNS通過上調肝組織中抗凋亡基因Bcl-2、下調凋亡基因Bax的表達，抑制損傷刺激后肝細胞過氧化凋亡，從而使匯管區結締組織減少，肝纖維化進程逆轉[44]。最新研究[45]顯示，PNS的抗肝纖維化作用除抑制肝細胞凋亡外，還可能與減少TGFβ1信號和關鍵轉錄因子Smad3的表達、調控TGFβ1/Smad通路轉導有關。因此，PNS或可作為抗肝纖維化的有效補充藥物。

2.5 黃酮類

2.5.1 槲皮素(quercetin，QUE) QUE是一種天然黃酮類化合物，廣泛存在于紫花地丁、仙鶴草、車前子、三七等中草藥中。QUE能降低核NF-κB的活化并增加胞漿NF-κB的表達，同時下調p38MAPK的水平，使肝組織中膠原蛋白沉積及炎性細胞浸潤減少[46]。此外，QUE能有效降低CCl4誘導的膠原產生及聚集、降低羥脯氨酸含量，并且肝組織中Wnt和β-catenin蛋白表達水平隨QUE劑量的增加而下降[47]，提示QUE的保肝及抗纖維化作用與Wnt/β-catenin信號通路有關。

2.5.2 荔枝核總黃酮(total flavone from litchi，TFL) TFL是從荔枝核中提取的黃酮類化合物。TFL干預CCl4及BDL誘導的2種不同大鼠模型，均可明顯降低肝組織中膠原面積及血清酶學指標，通過抑制NF-κBp65蛋白表達改善肝纖維化[48]。陳姍等[49]發現，TFL對HSC細胞的抑制作用具有量效關系，在濃度200 mg/L左右抑制率達最高，用ELISA法及qPCR法檢測出TFL組Smad3、Smad4含量明顯降低，TGFβ1-Smad通路拮抗因子PPARγ表達上調，證明了抑制TGFβ1/Smad信號通路是TFL抗肝纖維化的機制之一。

2.6 多糖類

2.6.1 石斛多糖(dendrobium polysaccharides，DP) DP存在于中藥材石斛的莖中，被證明能有效抑制HSC的激活而影響肝纖維化進程[50]。腸-肝軸是腸道和肝臟間的雙向交流通道，腸肝軸的存在使肝臟易受腸道抗原的刺激而誘發一系列炎癥反應，DP可以抑制腸道來源脂多糖對肝臟NF-κB信號通路的激活，從而減少炎癥因子的產生、減少膠原蛋白沉積以防止肝纖維化，還通過增強腸細胞的緊密連接來降低腸道屏障的通透性，維持腸道穩態，防止腸道抗原向肝臟的募集[51]，在預防和治療肝纖維化中均有一定作用。

2.6.2 枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides，LBP) LBP是從枸杞中提取的一種水溶性多糖。研究[52]表明，活化HSC分泌的胰島素樣生長因子-2(insulin-like growth factor-2，IGF-2)可通過與其受體結合產生促纖維化效應，而LBP則能降低肝組織及血液中IGF-2的表達量，抑制IGF-2生物學效應的發揮。LBP還可逆轉CCl4誘導的NF-κB表達上調，并與肝組織中的炎癥反應、氧化損傷及肝纖維化趨勢相一致[53]，提示LBP可能通過抑制NF-κB信號通路的表達來減輕模型大鼠肝纖維化。

2.6.3 狗肝菜多糖(dicliptera chinensis polysaccharide，DCP) DCP為爵床科草本植物狗肝菜的主要有效成分，具有保肝及抗纖維化活性。在DCP干預肝纖維化大鼠模型中，肝細胞損傷壞死、肝組織膠原纖維沉積程度隨DCP劑量的增加而減輕，MAPK通道相關蛋白、NF-κBp65蛋白的表達也有不同水平降低[54-55]，表明DCP可調控MAPK、NF-κB兩條信號通道，多水平、多環節地阻止肝纖維化進展。

現將中藥活性成分靶向信號通路抗肝纖維化的機制進行總結，見表1。

表1 中藥活性成分靶向信號通路抗肝纖維化的機制總結

3 總結與展望

肝纖維化是對肝損傷修復的代償反應，也是肝硬化、肝癌、肝衰竭的危險因素。肝纖維化病理過程復雜，多條信號通路參與其中。基于現代藥理學、基因組學等現代科學技術的發展，中藥活性成分抗肝纖維化的分子機制及細胞內信號通路的傳導過程被廣泛研究，并取得了良好的成果，具有廣泛的應用前景。然而，當前的研究大多僅停留在體外細胞實驗和動物實驗水平，中藥有效成分在臨床中仍以中醫配伍的形式存在，如何將基礎實驗結果運用于臨床，并在大型的臨床試驗中驗證中藥活性成分的抗纖維化作用，成為當前肝纖維化治療中面臨的又一挑戰。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：范文艷負責文獻檢索，撰寫論文；郝君玉、陳虹秀負責資料分析；劉光偉負責指導撰寫文章并最終定稿。