LINC01116靶向miR-203加劇氧糖剝奪/復氧誘導下人海馬星形膠質細胞損傷

黃正義, 趙增霞, 符秋紅, 劉淑云, 陳協輝

急性缺血性腦卒中(AIS)是一種常見的腦血管疾病,也是全世界范圍內引發60歲以上人群致殘和死亡的主要原因之一[1]。腦缺血再灌注損傷(CIRI)是指由缺血缺氧引起的腦組織損傷在重新獲得血氧供應后進一步加重甚至不可逆的病理過程。研究表明,CIRI涉及一系列病理變化,包括細胞增殖受損、凋亡增加、氧化應激和炎癥反應激活等,最終導致神經元損傷甚至壞死[2]。因此,進一步探究CIRI潛在分子機制,并尋找新的有效的治療靶點是十分必要的。

近年來眾多轉錄組測序與表達譜芯片證實,長鏈非編碼RNA (lncRNAs)與微小RNA (miRNAs)在AIS中異常表達并與疾病進展密切相關[3]。到目前為止,研究已報道了一些lncRNAs在CIRI中的詳細作用機制,如H19印記母體表達轉錄產物(H19)、轉移相關肺腺癌轉錄產物1 (MALAT1)、X染色體失活特定轉錄產物(XIST)及小核仁RNA宿主基因12(SNHG12)等[4]。作為一個lncRNA,LINC01116的研究主要集中在腫瘤方面,被發現與多種腫瘤進展有關,并可作為診斷與預后的新型生物標志物[5]。我們通過分析GEO數據庫中GSE122709與GSE140275結果,發現LINC01116在AIS患者外周血高表達,推測其可能在CIRI中發揮一定的作用。基于以上證據,本研究目的在于明確LINC01116在AIS海馬星形膠質細胞中的作用及相關分子機制。

1 資料與方法

1.1 主要試劑 RNA結合蛋白免疫沉淀(RIP)試劑盒來自美國Merck Millipore公司,人海馬星形膠質細胞(hHA)來自上海中喬新舟公司,杜爾貝科改良伊格爾培養基(DMEM)、無糖DMEM及胎牛血清(FBS)來自美國ThermoFisher公司,sh-Ctrl載體、sh-LINC01116載體、對照抑制物及miR-203抑制物來自上海吉瑪基因公司,Advanced高效DNA/RNA轉染試劑盒來自美國Zeta Life公司,細胞增殖/毒性試劑盒-8(CCK-8)與末端脫氧核苷酸轉移酶介導的原位缺口末端標記法(TUNEL)試劑盒來自上海生工生物公司,激活型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、真核翻譯起始因子2C2(AGO2)及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體來自美國Abcam公司,活性氧(ROS)與乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒來自蘇州碧云天生物技術公司,酶聯免疫吸附試驗(ELISA)相關試劑盒來自上海科艾博生物公司。

1.2 臨床標本 回顧性選擇了2018年1月-2019年12月期間在深圳市龍華區中心醫院經溶栓治療的131例AIS患者。納入標準：按照中國AIS診治指南2018版[6]診斷為AIS,且在發病6 h內入院治療。排除標準：AIS發病超過6 h,復發性AIS、短暫性腦缺血發作、腦出血、蛛網膜下腔出血、顱內占位性病變、意識障礙、嚴重肝腎功能不全、凝血功能障礙、惡性腫瘤及急慢性感染性疾病。收集所有的患者溶栓前后靜脈血5 ml,放置于抗凝管,并于-20 ℃保存備用。本研究已獲深圳市龍華區中心醫院倫理委員會審批,并得到所有參與者的知情同意。

1.3 方法

1.3.1 總RNA提取和反轉錄 取500 μl靜脈血,加入1.5 ml RNAiso Blood,充分混勻后,按照試劑盒提供步驟萃取總RNA。對于lncRNAs反轉錄,取1 μg總RNA,2 μl 5×PrimeScript RT Master Mix及適量去離子水至總體積為10 μl；之后依次37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,4 ℃ 30 min合成互補脫氧核糖核酸(cDNA)。對于miRNAs反轉錄,取2 μg總RNA,5 μl 2×mRQ Buffer,1.25 μl mRQ Enzyme及適量去離子水至總體積為10 μl；隨后按照37 ℃ 60 min,85 ℃ 5 min,4 ℃ 30 min合成cDNA。

1.3.2 實時熒光定量PCR 對于LINC01116實時熒光定量PCR試驗,取2 μl cDNA,10 μl 2×TB Green Premix Ex Taq II,0.4 μl 50×ROX Reference Dye,0.8 μl正向引物,0.8 μl反向引物及6 μl去離子水至總體積為20 μl；之后依次95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 45 s,共40個循環。對于miR-203實時熒光定量PCR試驗,取2 μl cDNA,12.5 μl 2×TB Green Advantage Premix,0.5 μl 50×ROX Dye,0.5 μl通用引物,0.5 μl miR-203引物及9 μl去離子水至總體積為25 μl；之后依次95 ℃ 15 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 20 s,共40個循環。反應結束后,分別以GAPDH和U6為內參基因采用2-ΔΔCt法計算LINC01116與miR-203表達水平。LINC01116正向引物：5’-CACCATGCCTGGCTGATTTGTC-3’,反向引物：5’-GTGTACTTCAGGGCCTTTGGGT-3’； GAPDH正向引物：5’-CATGGGTGGAATCATATTGGAA-3’,反向引物：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3’； miR-203引物：GTGAAATGTTTAGGACCACTAG；U6正向引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,反向引物：5’-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.3.3 細胞培養 hHA細胞復蘇后,采用DMEM和10% FBS培養,并在培養基中添加2 mmol/L谷氨酰胺、100 μg/ml鏈霉素及100 U/ml青霉素,置于含5%二氧化碳的恒溫(37 ℃)加濕培養箱中培養。

1.3.4 雙熒光素酶報告基因試驗 LINC01116-野生型(WT)序列包含與miR-203預測結合位點被擴增并插入pmirGLO雙熒光素酶miRNAs表達載體,建立報告載體pmirGLO-LINC01116-WT。同時使用GeneArt?定點誘變PLUS系統突變(MUT)LINC01116序列中包含與miR-203預測結合位點,建立報告載體pmirGLO-LINC01116-MUT。取對數期生長的hHA細胞接種至24孔板(約5×105/孔),培養過夜。第二天采用Advanced高效DNA/RNA轉染試劑將0.5 μg報告載體與30 nmol miR-203抑制物或30 nmol對照抑制物共轉染到細胞中并培養48 h。根據熒光素酶報告基因試劑盒檢測各孔熒光素酶活性。

1.3.5 RIP試驗 用4 ℃預冷的PBS緩沖液洗滌細胞后,加入RIP裂解緩沖液冰上孵育20 min,13,000 r/min離心30 min收集上清液。將100 μl上清液轉移至含有AGO2抗體(貨號：ab186733,稀釋倍數：1∶50)偶聯磁珠的RIP免疫沉淀緩沖液中,4 ℃孵育過夜后,以IgG抗體(貨號：ab172730,稀釋倍數：1∶250)作為對照。第二天將磁珠用RIP洗滌緩沖液洗滌3次,然后用蛋白酶K在55 ℃孵育30 min,并過柱純化提取RNA。最后檢測LINC01116與miR-203表達水平。

1.3.6 氧糖剝奪/復氧(OGD/R)模型建立 取對數期生長的hHA細胞接種至24孔板(約5×105/孔),培養過夜。第二天采用無糖DMEM和10% FBS培養6 h,培養條件為37 ℃、0.5% O2、94.5% N2和5% CO2。之后,去除所有培養基添加DMEM和10% FBS在37 ℃、95%空氣及5% CO2條件下繼續培養24 h,即建立OGD/R。

1.3.7 實驗分組及細胞轉染 體外hHA細胞實驗設為5個部分：分別為對照組、OGD/R組、對照干擾組、LINC01116干擾組及LINC01116聯合miR-203干擾組。對照組與OGD/R組不進行細胞轉染,而對照干擾組、LINC01116干擾組及LINC01116聯合miR-203干擾組利用Advanced高效DNA/RNA轉染試劑分別向細胞中轉染0.75 μg sh-Ctrl載體,0.75 μg sh-LINC01116載體及0.5 μg sh-LINC01116載體+30 nmol miR-203抑制物。

1.3.8 CCK-8 將細胞接種至96孔培養板(約8×103/孔),每組設計3個復孔,在培養0 h、12 h、24 h、36 h及48 h后向對應各孔加入12 μl CCK-8,繼續在37 ℃孵育4 h。隨后采用酶標儀測定各孔在450 nm波長時的吸光度值,并計算細胞增殖曲線。

1.3.9 TUNEL 將0.2%聚乙二醇辛基苯基醚加入爬片孵育5 min進行透膜處理。之后,用5 μmol/L TUNEL在37 ℃染色15 min。將爬片放入0.3%過氧化氫中孵育10 min,并用0.5 μg/ml 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚在黑暗中37 ℃染色5 min。利用熒光顯微鏡觀察細胞著色情況,并計算凋亡率(%)。

1.3.10 蛋白質印跡 提取細胞中總蛋白,取30 μg蛋白進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。利用濕轉膜法將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。將PVDF膜用5% 脫脂奶粉在37 ℃封閉2 h,隨后加入激活型caspase-3(貨號：ab32042,稀釋倍數：1∶500)、Bax(貨號：ab32503,稀釋倍數：1∶2500)、Bcl-2(貨號：ab32124,稀釋倍數：1∶1000)及和GAPDH(貨號：ab9485,稀釋倍數：1∶2500)抗體在4 ℃孵育過夜。第2天將PVDF膜用含辣根過氧化物酶標記的抗兔二抗(貨號：ab205718,稀釋倍數：1∶5000)在37 ℃孵育1 h。最后在避光環境中將PVDF膜用增強化學發光顯色試劑處理并曝光,采用Image Pro Plus7.0軟件分析灰度值并計算蛋白表達水平。

1.3.11 ROS與LDH試驗 取106個細胞重懸于10 μmol/L活性氧熒光探針(DCFH-DA)中,并在37 ℃孵育20 min。之后,用DMEM充分洗滌細胞去除未進入細胞內的DCFH-DA,利用熒光分光光度計測定細胞中ROS水平。向上清液中加入150 μl檢測液(稀釋10倍),并在37 ℃孵育1 h。隨后400 r/min離心5 min再次收集上清液,并取120 μl上清液加入到96孔板相應孔中,采用酶標儀測定各測試孔在490 nm波長時的吸光度值,并計算LDH活性。

1.3.12 ELISA試驗 將上清液和標準樣品分別放入測試孔內在37 ℃孵育2 h,之后用緩沖液洗滌測試孔。將ELISA試劑盒自帶的生物素標記抗體(TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10及IL-13)放入測試孔內在37 ℃孵育1 h。然后將鏈霉親和素標記的辣根過氧化物酶放入測試孔內在37 ℃孵育20 min,并與四甲基聯苯胺孵育20 min。通過酶標儀測定各測試孔在450 nm波長時的吸光度值,繪制標準曲線并計算炎癥因子濃度。

2 結 果

2.1 AIS患者溶栓前后血清中LINC01116與miR-203的表達水平及二者的關系 本研究共收集131例AIS患者,其中女54例,男77例,年齡29～83歲(57.41±9.26)歲。AIS患者溶栓后血清中LINC01116表達水平高于溶栓前,差異有顯著性(P<0.05)。AIS患者溶栓后血清中miR-203表達水平低于溶栓前,差異有顯著性(P<0.05)。LINC01116與miR-203表達呈負相關(P<0.05) (見圖1)。

A:溶栓后血清中LINC01116表達高于溶栓前;B:溶栓后血清中miR-203表達低于溶栓前;1C:LINC01116與miR-203表達呈負相關。與溶栓前比較*P<0.05

2.2 LINC01116與miR-203的調控關系 通過生物信息學分析,預測LINC01116轉錄產物(NR_040001.2)中“ATTTCA”序列可與miR-203中“TAAAGT”序列結合,提示miR-203可能受LINC01116調控。miR-203干擾顯著上調報告載體pmirGLO-LINC01116-WT熒光素酶活性(P<0.05),而不影響報告載體pmirGLO-LINC01116-MUT熒光素酶活性。AGO2抗體顯著富集LINC01116與miR-203表達(P<0.05)。二者結果表明,LINC01116通過“ATTTCA”序列海綿吸附miR-203(見圖2)。

A：雙熒光素酶報告基因試驗,與對照抑制物比較*P<0.05;B:RIP試驗分析,與IgG抗體比較*P<0.05

2.3 LINC01116干擾對miR-203表達的影響 OGD/R組中LINC01116表達水平高于對照組,而miR-203表達水平低于對照組,差異有顯著性(P<0.05)。LINC01116干擾組中LINC01116表達水平低于對照干擾組,而miR-203表達水平高于對照干擾組,差異有顯著性(P<0.05)。LINC01116聯合miR-203干擾組中miR-203表達水平低于LINC01116干擾組,差異有顯著性(P<0.05),表明LINC01116抑制miR-203表達(見圖3)。

A:各組中LINC01116表達水平比較;B:各組中miR-203表達水平比較。與對照組比較*P<0.05;與OGD/R組與對照干擾組比較#P<0.05;與LINC01116干擾組比較$P<0.05

2.4 LINC01116干擾與LINC01116聯合miR-203干擾對OGD/R誘導下hHA細胞損傷的影響 OGD/R組較對照組細胞增殖能力降低,細胞凋亡率升高,激活型caspase-3與Bax蛋白表達升高而Bcl-2蛋白表達降低,ROS生成增加,LDH活性升高,TNF-α、IL-1β及IL-6濃度上調而IL-4、IL-10及IL-13濃度下調(P<0.05),表明OGD/R誘導下hHA細胞損傷。LINC01116干擾組較OGD/R組與對照干擾組細胞增殖能力提高,細胞凋亡率下降,激活型caspase-3與Bax蛋白表達降低而Bcl-2蛋白表達升高,ROS生成減少,LDH活性下降,TNF-α、IL-1β及IL-6濃度下調而IL-4、IL-10及IL-13濃度上調(P<0.05),表明LINC01116干擾減輕OGD/R誘導下hHA細胞損傷。此外,miR-203干擾逆轉LINC01116干擾對OGD/R誘導下hHA細胞損傷的保護作用(P<0.05),表明LINC01116通過靶向miR-203促進OGD/R誘導下hHA細胞損傷(見圖4)(見表1)。

表1 各組細胞凋亡率與ROS生成及LDH活性比較

A:CCK-8試驗;B:蛋白質印跡試驗;C:ELISA試驗檢測TNF-α、IL-1β及IL-6濃度;D:ELISA試驗檢測IL-4、IL-10及IL-13濃度。與對照組比較*P<0.05;與OGD/R組與對照干擾組比較#P<0.05;與LINC01116干擾組比較$P<0.05

3 討 論

最新研究發現,LINC01116通過調節miR-203/SMAD5信號軸影響瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖、遷移和凋亡[7]。LINC01116 還可以通過海綿吸附miR-9-5p上調叉頭框轉錄因子P1促進子宮內膜基質細胞的增殖和遷移[8]。以上證據表明,LINC01116在各種疾病中具有廣泛的生物學功能。目前如何改善CIRI一直是提高AIS治療需面臨的重要問題。前期我們在AIS患者外周血lncRNAs表達譜中發現LINC01116高表達[9]。此外,多篇文獻證實異常表達的lncRNAs在CIRI中發揮重要的調節作用[10]。因此,我們推測LINC01116可能與CIRI有關。本研究通過一系列體外細胞實驗及機制驗證,發現LINC01116靶向miR-203促進OGD/R誘導下hHA細胞損傷,將為CIRI防治提供新的證據與潛在靶點。

越來越多的研究顯示,lncRNAs可作為CIRI治療的有希望的分子靶點。例如,Xu等[11]報道CAMK2D相關轉錄產物2(C2dat2)通過miR-30d-5p/DDIT4/mTOR軸促進CIRI中膠質細胞自噬和凋亡,表明C2dat2可能是CIRI有前景的治療靶點。Tu等[12]發現CEBPA反義轉錄產物1通過靶向miR-340-5p調節APPL1/LKB1/AMPK通路減輕CIRI。此外,Ni等[13]揭示核富集轉錄產物1(NEAT1)干擾調節小膠質細胞的活化并減少AKT信號和神經元凋亡,提示NEAT1可能是CIRI治療干預的潛在靶點。本研究在AIS患者溶栓后血清中檢測到LINC01116表達升高,與Zhu等[14]報道一致,表明可信度高。另外,最近Zhang等[15]一項研究證實LINC01116在急性髓性白血病患者血清中高表達。以上證據充分說明,LINC01116是一種循環lncRNA,提示其可能作為AIS的新型分子標志物。

膠質細胞廣泛參與調控炎癥與免疫反應,也對神經發生、血管生成和突觸重塑至關重要[16]。本研究采用hHA細胞建立OGD/R,經CCK-8、TUNEL與蛋白質印跡、ROS與LDH檢測及ELISA實驗發現細胞增殖能力降低,細胞凋亡率升高,激活型caspase-3與Bax蛋白表達升高而Bcl-2蛋白表達降低,ROS生成增加,LDH活性升高,TNF-α、IL-1β及IL-6濃度上調而IL-4、IL-10及IL-13濃度下調。以上結果表明,OGD/R誘導下hHA細胞損傷。有趣的是,還檢測到OGD/R中LINC01116表達上調,該結果與AIS患者溶栓后血清LINC01116高表達一致,提示LINC01116在CIRI中可能具有重要作用。

隨后進一步檢測LINC01116干擾對OGD/R誘導下hHA細胞損傷的影響,發現LINC01116干擾后細胞增殖能力提高,細胞凋亡率下降,激活型caspase-3與Bax蛋白表達降低而Bcl-2蛋白表達升高,ROS生成減少,LDH活性下降,TNF-α、IL-1β及IL-6濃度下調而IL-4、IL-10及IL-13濃度上調,表明LINC01116干擾可抵抗OGD/R誘導下hHA細胞損傷,提示其可能是CIRI治療的潛在分子靶點。本研究中LINC01116干擾促進細胞增殖并降低細胞凋亡,與其在膠質瘤中報道的作用相悖[17],可能原因是由于hHA細胞與腫瘤細胞的異質性所致,具體原因有待進一步闡明。

越來越多的實驗證實,lncRNAs作為ceRNA海綿吸附miRNAs而發揮表觀遺傳調控作用[18]。目前已報道的受LINC01116調控的miRNAs包括miR-9-5p[8]、miR-93-5p[19]及miR-744-5p[20]等。miR-203是一種高度保守的miRNA,定位于人第14號染色體q32.33區域,與腫瘤進展、2型糖尿病、氧化應激及炎癥反應有關[21,22]。最新研究發現,miR-203參與調節心肌缺血再灌注損傷[23]。此外,Zhong等[24]研究發現七氟醚治療后通過靶向髓樣分化因子88上調miR-203表達可以減輕CIRI誘導的神經炎癥。以上證據表明,miR-203在CIRI中具有保護作用。本研究發現AIS患者溶栓后血清與OGD/R中miR-203表達下調,且miR-203與LINC01116表達呈負相關,提示miR-203可能受LINC01116調控。進一步經雙熒光素酶報告基因與RIP試驗證實,LINC01116通過“ATTTCA”序列海綿吸附miR-203,表明miR-203是LINC01116的靶基因。最后通過回補實驗發現miR-203干擾逆轉LINC01116干擾對OGD/R誘導下hHA細胞損傷的保護作用,該結果與Zhong等[24]報道一致,充分表明LINC01116通過靶向miR-203促進OGD/R誘導下hHA細胞損傷。

綜上所述,本研究發現LINC01116在AIS患者溶栓后血清中高表達,LINC01116靶向miR-203促進OGD/R誘導下hHA細胞損傷,表明LINC01116/miR-203通路可能是AIS的潛在治療靶點。下一步將在大臨床樣本與動物模型中予以驗證,并探討該通路調控的下游分子。