貝類中甲肝病毒檢測技術研究進展

朱金艷，高 彬，孫淼淼，陳 思，楊 宇，麻麗丹

（1.莊河市檢驗檢測認證技術服務中心，遼寧莊河 116400；2.沈陽農業大學食品學院，遼寧沈陽 110866；3.莊河市農業發展服務中心，遼寧莊河 116400；4.大連海關技術中心，遼寧大連 116000；5.丹東海關，遼寧丹東 118000）

甲型肝炎病毒（Hepatitis A Virus，HAV）是平均孔徑大小約為27 nm、無病毒包膜、單鏈小核糖核酸病毒。全球每年感染HAV的人數約有1 000萬人，其中大約50%的感染源無法確定，僅有2%～3%的報告病例屬于食源性感染病例[1-2]。傳播途徑通常分為水型暴發、食物型暴發、散發式感染等[3]。目前很多研究人員都使用國際標準方法ISO 15216—2017或采用蛋白酶K法的提取方式對其進行檢測，而上述方式都存在回收率較低、操作煩瑣、耗時較長等問題[4]。為提升貝類檢測的規范性和準確性，本文對貝類樣品中HAV的提取和檢測方法的現狀展開論述，為貝類中HAV的檢測提供參考。

1 貝類中甲肝病毒污染

1.1 貝類中食源性甲肝病毒污染情況

許多國家的研究和數據證實了貝類是HAV的重要傳播載體。由于貝類通過消化系統過濾海水來獲取食物，能將海水中的病毒在體內積累，從而易于引發病毒型食源性疾病。2016年全世界有7 134人死于甲型肝炎，因此貝類的病毒污染給消費者帶來嚴重的健康風險，并且有可能給海鮮行業造成重大經濟損失[5]。

1.2 貝類中食源性甲肝病毒檢測存在的困難

病毒的傳染劑量很低，少量病毒顆粒就可以造成大量傳染，并且病毒顆粒在離體條件下，以無生命的生物大分子狀態存在，并保持其侵染性。此外，這種病毒的序列變異較大，血清型也較多。貝類食源性甲肝病毒檢測中所存在的問題主要有以下幾點。①貝類食物中的HAV濃度較低。②HAV培養周期較長，很難實現快速測定。③從病毒中提純RNA的有效性較低。④貝類的生長環境復雜，導致其存在多種干擾雜質。

2 貝類中食源性甲肝病毒的提取方法

RNA的提取是病毒檢驗的關鍵步驟。病毒的提取是從食物基質中分離出病毒，去除抑制性化合物，并濃縮一定體積。甲肝病毒RNA的提取方法主要有3種，分別為酸吸附—洗脫—濃縮法、直接提取RNA法和蛋白酶K處理法。

2.1 酸吸附-洗脫-濃縮法

酸吸附—洗脫—濃縮技術用于從碳水化合物 、脂肪、蛋白質食品以及貝類產品中提取食源性病毒。通常洗脫步驟需使用中性或堿性洗脫緩沖液。PAPAFRAGKOU等通過酸吸附—洗脫—濃縮方法從5 g牡蠣中檢出HAV為2×100～102RT-PCRU[6]。

2.2 直接提取病毒RNA法

直接提取病毒RNA法是采取物理或化學的方法，直接破壞病毒分子，提取病毒RNA。直接提取病毒RNA法已成功應用于脂肪、蛋白質類食品，研究數據顯示，利用鋯珠粉碎牡蠣消化組織，再通過直接提取病毒RNA法從0.15 g的牡蠣消化組織中成功提取到10 RT-PCRU[7]。

2.3 蛋白酶K處理法

利用蛋白酶K的消化功能，可以將貝類樣本消化組織中的病毒分子更好地釋放出來，提高病毒RNA的提取效率。一般情況下，經蛋白酶處理的樣品可以經過PEG沉淀濃縮或高速離心濃縮進一步提高檢測的靈敏性。近年來，市場上可供使用的商業病毒RNA提取檢測試劑盒日漸增多，極大地改善了RNA的提純操作步驟，有效提升了RNA擴增檢測的靈敏度和獲取效果[7]。

3 貝類中甲肝病毒的檢測方法

貝類中甲肝病毒的檢測方法目前主要有分子生物學法、斑點金免疫結合法、近紅外免疫層析法、電化學免疫法和電鏡觀察法。

3.1 分子生物學

3.1.1 PCR法

PCR法即聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction，PCR），是以DNA為模板，特定引物為起點，在DNA聚合酶的作用下進行延伸，利用核苷酸底物通過變性、退火、延伸等步驟，將DNA增加到所需數量進行分析的過程。通常PCR法無法對貝類中甲肝病毒指定基因組定量，且敏感度較低，導致該法在檢測中的使用受到限制。

3.1.2 RT-PCR法

RT-PCR即逆轉錄PCR法（Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction），是將RNA的反轉錄RT和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術。RT-PCR法由于效率較高、價格低廉，在實驗室中使用較為廣泛[6]。但存在的問題是每次反應僅擴增一次模板，在實際使用中很難做到同時處理大批量的樣品。喬煜婷等用免疫磁珠法提取病毒后，采用RTPCR檢測法順利地測定到了水域土壤中殘留的甲型肝炎病毒，具有特異性強、靈敏度高、重復性好等優勢[8]。

3.1.3 RT-qPCR

RT-qPCR法即實時熒光PCR定量法（Real-Time-Quantiative PCR），熒光物質被添加到PCR反應體系中，并在每個PCR周期后實時監測熒光體信號的積累，以便對起始模板進行定性和定量分析。目前此法應用于食品行業檢測、分子生物學研究、臨床疾病診斷等方面。

3.1.4 基因芯片檢測法

基因芯片檢測法是一種微芯片技術，通過機器或原位合成將高密度的DNA片段按特定順序附著在固相表面，用同位素或熒光材料對DNA探針進行標記，以實現基于堿基互補雜交原理的詳細基因表達和監測研究。該方法具有檢測信息量大、可行性強和系統集成化等多種優勢。目前基因芯片法研究需要建立穩定的、系統的技術規范才能在病毒篩查與預防病毒感染中廣泛應用。

3.2 斑點金免疫結合法

斑點金免疫結合法是以微孔濾膜為載體，通過滲濾作用使抗原抗體快速進行反應。劉瑛等研究了斑點金免疫球蛋白結合法用于HAV的檢測。該方法具有使用快捷、保留時間長的優點，但存在標本誤讀的現象，且成本高，準確度低，這兩個因素限制了斑點金免疫法的廣泛應用[9]。

3.3 近紅外免疫層析技術法

近紅外免疫層析法是將近紅外熒光技術和熒光免疫層析技術相結合產生的一種新型側向流技術，具有背景熒光量小、檢測靈敏度高的優點。利用近紅外熒光染料成功制備用于檢測食品樣品中甲肝病毒的近紅外免疫層析試紙條[10]。

3.4 電化學免疫傳感器法

電化學免疫傳感器法是通過將抗體或抗原和電機組合而成的檢測裝置。該方法具有電化學穩定性好和生物選擇性高的特點，目前已被成功地應用于水樣分析中HAV值的測定。電化學免疫傳感器可同時快速檢測到各種類型的HAV抗原，雖然敏感度較高，但需要大批高品質的納米金顆粒和蛋白質A，增加了檢測成本[11]。

3.5 電鏡觀察法

電鏡觀察法具有直接、安全的優點，但病毒在電鏡下的形態學特征并不突出，且靈敏度不高，同時對技術條件要求苛刻，因此無法直接應用于樣品的檢測[12]。

4 結語

因食用貝類產品而感染HAV已成為全球重要的公共衛生問題之一。因此，國內外相關的食源性HAV檢測方法也在不斷更新與完善。現如今貝類中HAV的檢測方式日益多樣化、深度化，在便利性、快速性和準確度等方面均有所突破。貝類屬于低劑量病毒感染，病毒RNA的提取、檢測方法都需要進一步創新研究。在此基礎上，建立貝類的快速檢測體系能有效防止感染HAV，避免暴發病毒感染事件。