外泌體在心肌缺血再灌注損傷中作用的研究進展

李昕璽 劉長梅 祝慧 翟淼浡 商雪 趙嘉昊 徐會圃

1濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，濱州 256600；2濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，濱州 256600

目前，急性心肌梗死的發(fā)病率不斷增加，已成為全世界范圍內(nèi)重大的公共衛(wèi)生問題。而在急性心肌梗死患者的治療中，溶栓、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）以及冠狀動脈旁路移植（CABG）等心肌再灌注治療是減少梗死面積、挽救瀕死細胞的有效治療策略。然而，再灌注治療在挽救心肌的同時也可誘發(fā)心肌頓抑、再灌注心律失常和無復(fù)流現(xiàn)象等一系列心臟不良事件，引起心肌缺血再灌注損傷（MIRI）［1］，影響患者預(yù)后。目前針對MIRI尚缺乏有效的治療策略，因此，探索改善缺血再灌注損傷的機制、預(yù)防或減輕缺血再灌注損傷，將有助于改善急性心肌梗死患者的預(yù)后。

外泌體是由細胞主動分泌的具有雙層脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的小囊泡［2］，能夠通過轉(zhuǎn)運細胞內(nèi)的相關(guān)物質(zhì)（包括酶、細胞因子、DNA和非編碼RNA等）參與細胞間通訊［3］。其最早是在二十世紀(jì)80年代由Johnstone等［4］在綿羊網(wǎng)織紅細胞體外培養(yǎng)的過程中發(fā)現(xiàn)并命名的。隨著對外泌體研究的日益深入，研究者們發(fā)現(xiàn)外泌體在體內(nèi)眾多生物過程中均起著重要作用，如細胞分化、炎性反應(yīng)、抗原提呈、免疫應(yīng)答以及腫瘤發(fā)生發(fā)展等。幾乎所有的細胞類型均可分泌外泌體，其表面標(biāo)志物主要有CD63、CD81、CD9、ALG-2互作蛋白X（Alix）、腫瘤易感基因101（TSG101）、熱休克蛋白27（HSP27）等［5］。2007年，Gupta和Knowlton［6］首次報道缺氧復(fù)氧條件下培養(yǎng)的心肌細胞能夠釋放外泌體。外泌體在心肌細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞之間可以充當(dāng)細胞間通訊信使，并參與心血管疾病中細胞再生、心室重塑和血管生成等過程的調(diào)節(jié)［7］。在過去十年中，隨研究的不斷深入，外泌體已成為心血管疾病重要的治療手段或生物標(biāo)志物之一，本文將對外泌體、MIRI以及外泌體對MIRI作用機制進行探討。

MIRI的機制

MIRI與分子、細胞以及組織改變?nèi)缪趸瘧?yīng)激、炎癥、中性粒細胞活化以及細胞死亡等過程均有關(guān)。而再灌注損傷的主要介質(zhì)是氧自由基、鈣負荷和中性粒細胞等［8］。

1、氧自由基損傷

氧自由基性質(zhì)極其活潑，能夠誘導(dǎo)體內(nèi)其他物質(zhì)的氧化修飾，其產(chǎn)生在冠狀動脈閉塞再灌注后的前幾分鐘達到高峰［9］，能夠?qū)е掳さ牟伙柡椭|(zhì)或蛋白質(zhì)過氧化，線粒體是氧自由基攻擊的主要目標(biāo)。雖然氧自由基可以被體內(nèi)的超氧化物歧化酶（SOD）催化為過氧化氫，但在急性缺血損傷后細胞水平的SOD急劇減少，打破了這種平衡，并為隨后再灌注后氧自由基的激活提供了基礎(chǔ)［10］。有研究建立了MIRI犬模型，在再灌注期間給予SOD和過氧化氫酶（CAT）清除氧自由基后，雖然梗死面積沒有顯著減少，卻顯著改善再灌注期間的局部心肌血流量并保存了嚴(yán)重受損心肌細胞區(qū)域微血管的超微結(jié)構(gòu)［11-12］。因此再灌注過程中氧自由基還可以通過損傷微血管導(dǎo)致心肌組織損害。

2、炎性反應(yīng)

當(dāng)機體受到侵犯時，特殊分化細胞（如巨噬細胞等）會識別并啟動炎癥的級聯(lián)反應(yīng)，而中性粒細胞會快速識別這種反應(yīng)，移動到啟動并釋放促炎介質(zhì)的地方來發(fā)揮作用。而生理狀態(tài)發(fā)生改變時，中性粒細胞這一反應(yīng)可致組織損傷。在MIRI的過程中，損傷的心肌細胞以及血管內(nèi)皮細胞發(fā)出炎癥信號［13-14］，導(dǎo)致中性粒細胞移動并激活，釋放能夠損傷再灌注區(qū)域內(nèi)鄰近內(nèi)皮和心肌細胞的毒性產(chǎn)物，包括蛋白水解酶、血小板活化因子和氧自由基等，引起自身組織的破壞。同時，該過程常伴隨著促炎細胞因子的釋放，如腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-1和IL-6［14］。這些細胞因子反過來誘導(dǎo)內(nèi)皮、中性粒細胞和心肌細胞表面黏附分子暴露，并刺激IL-8的釋放，能夠顯著促進炎癥以及中性粒細胞的激活。有研究表明，MIRI時心肌釋放的細胞外熱休克同源蛋白［15］，可以通過Toll樣受體4（TLR4）信號在缺血后的炎性反應(yīng)中起關(guān)鍵作用［16］。

3、線粒體功能障礙

在再灌注過程中，氧重新進入心肌細胞會對線粒體信息傳遞鏈造成損傷，增加氧自由基的產(chǎn)生。而線粒體Ca2+超載和氧自由基產(chǎn)生增加都促進線粒體膜上的非選擇性通道線粒體膜通透性轉(zhuǎn)化孔（PTP）的開放，使細胞能量紊亂，導(dǎo)致不可逆的細胞壞死和凋亡［17］。PTP的開放成為致死性再灌注損傷的關(guān)鍵決定因素。在心肌缺血期間，線粒體PTP保持關(guān)閉狀態(tài)，僅在心肌再灌注后的前幾分鐘內(nèi)開放，以應(yīng)對線粒體Ca2+超載、氧化應(yīng)激、H+濃度升高以及三磷酸腺苷（ATP）的消耗。而缺氧時間較長導(dǎo)致缺氧嚴(yán)重時，PTP開放時間過長，使線粒體膜電位嚴(yán)重失衡導(dǎo)致氧化磷酸化解偶聯(lián)，最終出現(xiàn)ATP耗竭以及細胞死亡。

另外，隨著心肌細胞的缺血缺氧，細胞以及胞膜功能障礙，各種代謝以及離子轉(zhuǎn)運紊亂，Ca2+順膜內(nèi)外離子濃度差進入細胞內(nèi)；同時，H+作為無氧糖酵解的結(jié)果在細胞內(nèi)積累。灌注恢復(fù)后，為了使細胞內(nèi)pH值正常化，H+被轉(zhuǎn)運到胞外來交換Na+。細胞內(nèi)Na+的增加激活2Na+/Ca2+轉(zhuǎn)運體，導(dǎo)致細胞內(nèi)Na+與細胞外Ca2+的交換。高比率的Na+/Ca2+交換會導(dǎo)致Ca2+超載和細胞死亡［18］。另有其他研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血再灌注時還可以通過Rap1等途徑促進心肌細胞凋亡，引起相應(yīng)的心肌損害。

外泌體對MIRI的作用

外泌體是細胞主動分泌的胞外小囊泡。既往的研究表明，多種細胞來源的外泌體能夠分泌細胞因子、生長因子以及趨化因子等。生理狀態(tài)下，細胞可以釋放少量的外泌體，而在一定的內(nèi)、外刺激（如信號通路激活、應(yīng)激等）情況下，可以誘發(fā)細胞分泌大量的外泌體。缺血缺氧對組織器官來說是巨大的刺激，多種細胞分泌的外泌體均發(fā)生變化，這些外泌體首先進入周邊細胞外液，并最終匯聚于血液循環(huán)中到達靶細胞、靶組織而發(fā)揮相應(yīng)作用。外泌體是有著雙層膜結(jié)構(gòu)的帶負電荷（-26 mV）的微粒，并表達CD63、CD81等表面分子，這些特性使得它易于被MIRI心肌細胞攝取吸收，并遞送其攜帶的生物活性分子。有研究表明外泌體是新生血管形成、細胞增殖和凋亡過程中的重要調(diào)節(jié)因子［19］，能夠通過多種機制改善缺血再灌注后損傷的心肌以及心功能。

1、抑制炎性反應(yīng)

炎性反應(yīng)是導(dǎo)致MIRI的一個重要機制。在MIRI小鼠模型中，再灌注后給予骨髓間充質(zhì)干細胞來源外泌體的小鼠與對照組小鼠相比，心肌梗死面積減少，炎癥細胞浸潤減少；同時，外泌體處理后的小鼠心臟組織中促炎因子IL-6減低更顯著，而抗炎因子IL-10的濃度則顯著增加［20］。而大鼠M2型巨噬細胞來源的外泌體可以通過攜帶miR-148a來下調(diào)硫氧還蛋白相互作用蛋白（TXNIP）的表達并使TLR4/NF-κB/NLRP3炎性體信號通路失活以減輕MIRI［21］。另外，SIRT7可以參與心肌細胞凋亡和應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)，且其表達隨著急性心血管損傷的加重而增加，在缺血再灌注心肌組織和細胞中SIRT7表達上調(diào)，骨髓間充質(zhì)干細胞來源的外泌體可以通過轉(zhuǎn)運miRNA-125b來負性調(diào)節(jié)SIRT7從而抑制心肌細胞炎癥應(yīng)激以及細胞凋亡，減輕缺血再灌注損傷［22］。

2、抗氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致缺血再灌注損傷的重要原因之一。在相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，在再灌注后30 min內(nèi)，外泌體處理后動物的ATP/ADP和NADH/NAD+比率顯著增加［23］。同時，作為心肌缺血/再灌注損傷的標(biāo)志特征，氧化應(yīng)激的程度在再灌注的第1小時內(nèi)也有一定程度的降低。這表明，外泌體治療在引發(fā)快速生化反應(yīng)以恢復(fù)ATP和NADH水平以及減少氧化應(yīng)激方面效果較為顯著。另外，陳琮［24］對MIRI的小鼠分別予以等量的外泌體以及生理鹽水治療，與生理鹽水治療的對照組相比，外泌體治療組小鼠心肌中ATP和NADH的水平明顯增加，同時，增加了磷酸化的Akt和磷酸化的GSK-3β，并減少了磷酸化的c-JNK，而經(jīng)過外泌體治療的小鼠，減低了氧化應(yīng)激，心功能得到明顯改善。外泌體的抗氧化應(yīng)激的功能一定程度上可以改善MIRI的預(yù)后。

3、誘導(dǎo)自噬減輕細胞凋亡

細胞缺血或缺氧損傷后的自噬增強具有一定的心肌保護作用，而缺血再灌注后過量氧自由基的產(chǎn)生可以導(dǎo)致細胞自噬功能的降低。研究發(fā)現(xiàn)，H2O2誘導(dǎo)的H9C2心肌缺血再灌注模型中，自噬蛋白LC3B-Ⅱ水平降低，同時，作為自噬退化的標(biāo)志，P62在暴露于H2O2的H9C2心肌細胞中相對于對照組顯著降低；為進一步觀察外泌體對細胞自噬的影響，用Baf-A1抑制細胞自噬后，與僅H2O2組相比，在H2O2+外泌體組中，自噬基因Beclin-1和LC3B-Ⅱ的表達顯著增強，P62的表達顯著降低，且與H2O2暴露組相比，外泌體處理組的自噬體和自噬溶酶體均顯著增加［25］。同時，骨髓間充質(zhì)干細胞衍生的外泌體可以通過調(diào)節(jié)AMPK/mTOR途徑增強心肌細胞自噬。另外，缺血再灌注期間心肌細胞外泌體的釋放能夠減少體外缺氧導(dǎo)致的心肌細胞凋亡［26］。

4、促進血管新生

心肌缺血后血管再生保證血液以及氧供是減輕損傷的關(guān)鍵措施。有研究表明，來源于遠端缺血預(yù)處理大鼠血漿中的外泌體可以通過促進HSP70的表達顯著提高細胞活力，增加內(nèi)皮細胞細胞分裂G1期的細胞百分比、細胞遷移、增殖、血管形成并抑制細胞凋亡，同時還可以通過引起的iNOS、缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α、Ang-I和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的顯著表達增加來促進血管再生，從而減輕缺血再灌注損傷［27］。Ma等［28］研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠缺血心臟移植表達miR-132的外泌體后明顯增強了梗死周邊區(qū)的新生血管形成，保護了心臟功能。

5、減少梗死面積，減輕心肌重塑

心室重塑是導(dǎo)致患者發(fā)生心力衰竭，影響急性心肌梗死患者遠期預(yù)后的主要原因。Yu等［29］發(fā)現(xiàn)，在人間充質(zhì)干細胞中存在過表達鋅指轉(zhuǎn)錄因子-4（GATA1 binding factor-4，GATA-4），將急性心肌梗死兔模型給予間充質(zhì)干細胞來源的外泌體處理后，發(fā)現(xiàn)心肌梗死面積明顯減小。同時，有研究表明，骨髓間充質(zhì)干細胞衍生的外泌體能夠通過PI3K/Akt途徑減輕心肌細胞重塑，而該途徑還是一種常見的細胞自噬途徑，骨髓間充質(zhì)干細胞來源的外泌體可以通過該途徑抑制心肌重塑，促進細胞自噬，從而減輕MIRI［23］。

展望

外泌體通過在細胞間傳遞功能蛋白等物質(zhì)，可以對損傷的修復(fù)和恢復(fù)產(chǎn)生即時的生理反應(yīng)，是一種體內(nèi)理想的載體。不同細胞來源的外泌體可以分泌細胞因子、趨化因子和生長因子等，這些因子可以主要通過促進心肌和血管組織的生長和再生來修復(fù)受損的心臟組織，從而減輕MIRI。外泌體這些作用為我們研究組織損傷和修復(fù)的細胞間調(diào)節(jié)提供了新的視角，并為組織修復(fù)生物制劑的開發(fā)提供了新的途徑，同時也為我們探究外泌體新的功能提供了思路。如果外泌體可以激活心臟保護途徑，那么我們可以通過操縱它在血液中的濃度來進一步影響心臟保護機制。目前尚未開發(fā)出用于體內(nèi)改變外泌體產(chǎn)生的特定藥物制劑。最近有許多研究提出采用肢體遠端缺血預(yù)處理可以增加血液中外泌體的數(shù)量并改變轉(zhuǎn)運物質(zhì)來發(fā)揮相應(yīng)的心臟保護作用。同時，我們猜想外泌體參與心臟保護可能代表了外泌體在參與組織修復(fù)中的一般功能。不同的細胞類型可能會產(chǎn)生針對特定類型細胞或損傷的外泌體，這些外泌體極有可能成為診斷疾病以及判斷預(yù)后的有效生物學(xué)標(biāo)志。