冠狀動脈微血管內皮細胞功能障礙分子機制的研究進展

吳小雷

皖南醫學院第二附屬醫院心血管內科，蕪湖 241000

近年來隨著冠狀動脈微血管疾病的發生、發展，現已逐漸受到多數醫學工作者們的關注。2017年我國有關共識將冠狀動脈微血管疾病定義為受多種相關致病因素的影響下，機體冠狀小動脈以及小動脈功能或結構異常而導致的心肌缺血或心絞痛等具有客觀證據的綜合征［1］。近年來亦有相關研究發現，臨床癥狀表現為胸痛，但通過冠脈造影結果顯示為正常的健康體檢者中，冠狀動脈微血管疾病患者的發病率高達60%左右，且在該類患者中心肌梗死、心肌缺血以及心絞痛等相關心血事件的發生率明顯升高，推測冠狀動脈微血管疾病的發生可能是導致該類患者預后不良的重要因素［2］。此外，冠狀動脈微血管疾病的致病因素較為復雜，且波及的人群較為廣泛，臨床亦缺乏規范且科學的檢測手段，進而給冠心病的系統管理及防治工作帶來了巨大挑戰［3］。因此，進一步加深對該病的認知就顯得尤為重要。此外，導致冠狀動脈微血管疾病發生的相關危險因素與冠狀動脈粥樣硬化相似，包括高游離脂肪酸、高血壓、衰老以及糖尿病等，而這些因素均以損害機體血管內皮細胞結構和機體血管內皮細胞功能為病理特征。相關研究發現，冠狀動脈微血管細胞約占心臟內細胞總量的1/3，同時在維持冠狀動脈微血管正常運轉期間發揮重要作用，且冠狀動脈微血管細胞功能發生異常時，其正常情況下均先損傷心?。?］。冠狀動脈微血管內皮細胞（CMEC）功能障礙主要是指在相關病理作用下，CMEC的增殖、遷移、粘附、凋亡以及分泌等功能受損，進而導致CMEC功能發生障礙，導致冠狀動脈微血管收縮，心肌供血異常等，同時亦是CMEC功能異常的早期表現，現階段關于CMEC功能障礙的相關機制雖然尚未闡明，本研究現就CMEC功能障礙的分子機制展開綜述。

線粒體活性氧自由基（ROS）的積累

細胞在機體中的正常生長以及代謝期間均可產生ROS，但通過在多種相關機制的作用下亦可使氧化還原狀態持續保持平衡［5］。在高血壓或糖尿病患者中，由于機體中的高血壓、高胰島素、高血糖對血管內皮刺激，進而導致機體內皮細胞的應激水平上升，因此，高血壓、高胰島素、高血糖亦被認為是導致該類患者CMEC功能發生障礙的主要因素。當機體血壓升高期間亦可導致血管緊張素表達水平上升，激活蛋白激酶C（PKC）所依賴的煙酰胺脫氫酶，進而誘導機體超氧陰離子表達水平上升。此外，在炎癥因子、高血脂以及高血糖等因素影響下，機體血管內皮細胞促氧化酶活性增強，促使ROS表達水平提高。同時ROS大量累積亦會導致一氧化氮信號通路受到影響，降低一氧化氮信號通路生物利用度，進而促使微血管內皮功能發生障礙。除上述直接參與的氧化還原相關蛋白外，亦有學者發現還存在其他相關蛋白參與了ROS相關的信號通路，進而引起CMEC積累，激活叉頭框蛋白1（FoxO3A），FoxO3A激活后不僅能夠降低ROS表達水平，同時亦能有效抑制B細胞淋巴瘤因子2xL（Bcl2-xL），最后一刻觸發CMEC凋亡［6］。Bax抑制劑1通過抑制黃瞟吟氧化酶/F-肌動蛋白信號通路，進而調節線粒體融合，減輕機體因缺血在灌注而導致的CMEC損傷。此外，在復氧/缺氧的模型中，CMEC/ROS信號通路激活早期生長反應因子1（Egr-1）轉至下游基因，進而導致CMEC損傷。綜上，ROS在CMEC損傷的機制不僅復雜且涉及多個層次，原因可能與機體細胞所處的環境、ROS表達水平等相關。當ROS水平處于相對較低的情況下，線粒體內參與氧化還原平衡的抗氧化相關蛋白，當ROS表達水平上升至一定程度后促使氧化還原失衡，ROS可能更多作為信號傳導分子用以去激活信號通路以及蛋白進而引起生物學反應?，F階段有關下游通路雖然較為復雜，但能夠確定是機體細胞所處的應激背景（高糖、脂肪酸炎癥以及缺氧等）對ROS細胞及其介導的信號有一定影響。

一氧化氮合酶（NOS）信號通路失調

NO是機體血管功能重要的穩態調控因子，其主要是由L-精氨酸化合物在NOS的催化下進行形成［7］。現階段，已知在人體血管內皮細胞中存在2種NOS，包括損傷后出現的損傷后誘導型一氧化氮合成酶（iNOS）以及內皮型一氧化氮合酶（eNOS）。eNOS屬于鈣離子（Ca2+）依賴的一種酶，而iNOS是非Ca2+依賴并受內毒素以及細胞因子調控，且eNOS在催化水平較低的NO（nmol級）時，對血管穩態發揮著重要的調節作用，而iNOS在催化水較高的NO（μmol級）時其參與了機體多種病理的發展過程。內皮細胞受氧化應激刺激后，內皮細胞中Ca2+釋放，Ca2+與鈣調素相結合進而形成的復合物進而激活eNOS，eNOS在血紅素、黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）以及黃素單核苷酸（FMN）等輔助因子的調控下，進而導致NO半衰期縮短，使其加快釋放同時進入血液并與血紅素結合，從而激活鳥苷酸環化酶（cGMP），使其水平增高，受蛋白激活酶的激活后亦可維持血管穩態、調節血管舒張。此外，亦有研究發現eNOS活性以及eNOS信號受阻是多種血管疾病發生的核心特征，現階段尼可地爾是首選治療因CMEC功能障礙誘發心絞痛的藥物，通過活化靜脈血管平滑肌促使cGMP上升，進而發揮血管擴張，改善血管供血作用［8］。影響NOS輔助因子活性以及相關底物亦可干擾NOS的信號通路，在一項動物研究中發現，CMECBH4表達水平上升可有效抑制或是緩解因糖尿病所致的NO依賴血管舒張損傷［9］。此外，ROS作為CMEC損傷的病例因子，其表達水平上升可使NO降解加速，采用活性氧清除劑干預CMEC亦可明顯增加NO生物的利用度，改善機體血管功能，提示ROS在NOS信號通路中有負調控的作用。此外，亦有其他相關的信號通路同樣參與了NOS的活性調節。相關研究發現，PI3K/AKT通路可激活人源eNOS，促使CMEC加速釋放NO，進而可緩解因缺血再灌注所誘發的受損血管功能［10］。上述可知，在CMEC中，NOS受多種輔助因子、底物以及酶的調控，且PI3K信號通路在eNOS酶活性的調控中可能發揮著重要作用。

細胞代謝通路紊亂

細胞的代謝功能在機體細胞分化期間和生物功能極為重要，機體如果出現如高游離脂肪酸、高血糖等代謝紊亂情況，亦可導致患者心血管事件發生的風險增加。有關研究表明糖尿病患者血管細胞代謝及心肌出現異常情況可能是促使其發生相關心血管事件的主要原因［11］。此外，患者冠狀動脈功能障礙亦可促使心肌供血異常，進而引發糖尿病性心肌疾病。在高糖引起的細胞代謝異常期間，ROS的大量累積和細胞凋亡信號通路是導致CMEC受損的重要分子事件。CMEC在高糖的環境下其葡萄糖代謝表達水平更高，而在這種情況下ROS表達水平亦會隨之升高，現階段已發現競爭性糖酵解抑制劑2-DC可有效降抑制因高糖誘導的血管內皮細胞中的超氧化物生成，由此可知，由高糖所誘發的高水平糖酵解是血管內皮細胞中的超氧化物持續生成的主要因素。此外，相關研究發現，機體高糖狀態未改eNOS以及iNOS表達水平產生影響，但其降低了機體細胞中的谷胱甘肽（GSH）表達水平，提高了NAD（P）H氧化酶膜結合組分p22-phox的水平表達，同時發現，CMEC內氧自由基主要來源于NAD（P）H，由此認為，高糖所致CMEC氧化應激異常的原因可能與抗氧化蛋白表達水平降低促氧化酶活性提高相關［12］。現階段關于高糖對GSH的調控機制未完全闡明，關于血管平滑肌的相關研究結果僅表明，高糖所誘發的抗氧化蛋白表達水平異?？赡芘cGSH合成限速酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）水平及活性相關［13］。但對于能否可類推至CMEC尚未確定。另外，高糖所致的代謝異常亦可激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路，隨后抑制了細胞自噬過程，進而促進CMEC凋亡。近年來亦有相關研究證實，臨床用于治療CMEC的尼可地爾可通過促進細胞自噬用以保護晚期糖基化終末產物所致的CMEC損傷，故細胞自噬亦可能是高糖狀態誘發CMEC損傷的干預靶點之一［14］。由上述認為，高糖狀態所誘發的CMEC損傷機制可能是多方面的。除高糖損傷血管外，高脂肪酸血癥也會導致心臟微血管損傷，同時機體游離脂肪酸異常也會導致CMEC發生損傷，圍脂滴蛋白5屬于重要的脂肪酸代謝蛋白，圍脂滴蛋白5異常降低亦可導致脂滴減少，游離脂肪酸濃度增加進而促使ROS大量生成，導致eNOS活性及表達水平顯著降低，最終CMECNO促使血管內皮細胞發生凋亡。正常情況下血管內皮細胞均通過代謝的方式進行糖酵解，而受脂肪酸水平上升的刺激下亦會導致內皮細胞轉向給予依賴氧化脂肪酸提供能量，在此期間會使ROS大量產生，進而導致內皮細胞功能發生障礙，因此，在臨床治療中，關于脂肪酸代謝異常的情況亦不可忽視。

細胞衰老信號通路活化

衰老屬于影響心血管疾病公認的獨立危險因素。在一項動物研究中發現，冠狀動脈血流儲備（CFR）功能及內皮依賴性血管舒張隨著年齡不斷上升而持續減少［15］。其相關機制可能與機體舒張因子分泌量降低、細胞失活以及收縮因子釋放相關。血管內皮功能受到損傷后，舒張因子所發揮的抑制作用相對降低，進而導致機體血小板和免疫細胞大量聚集，直接影響機體內皮細胞功能。近年來有相關研究發現，與機體衰老相關的Sirtuins家族蛋白直接參與了CMEC功能障礙［16］。在動脈粥樣硬化（AS）以及衰老中，微血管內皮細胞miRNA 217的水平上升，進而抑制身為Sirtuins家族一員的沉默信息調節因子1，促使細胞內皮信號發生改變同時eNOS活性下降，進而導致血管內皮細胞功能發生障礙。此外，Sirtuins家族中的另一個成員沉默信息調節因子3可隨著機體衰老而持續降低，其主要位于線粒體，對細胞代謝以及線粒體具有調節作用，同時亦可幫助機體心肌細胞抵抗衰老和應激損傷。Sirtuins家族在衰老過程中對機體內皮細胞功能所發揮的作用可能與Sirtuins家族蛋白去乙?；刚{控線粒體應激反應及調控線粒體的代謝相關。此外，ROS同樣參與了CMEC的衰老過程，相關文獻表明，ROS表達水平上升可導致CMEC的細胞周期發生增殖抑制、停滯等，使其出現衰老表型，而FOXO3作為與人類長壽相關聯的蛋白質，其通過抑制ROS信號通路后可有效延緩CMEC衰老，此外，衰老會提高如腫瘤壞死因子-a（TNF-α）等脂肪來源的細胞因子表達水平，這亦是促使CMEC功能發生障礙的重要因素［17］。

炎癥信號激活

炎癥信號在CMEC功能障礙的發生以及發展中發揮了極為重要的作用，炎癥因子可導致內膜增厚、血管內皮損傷，亦會導致血管內皮細胞NO和前列環素合成及其類似物合成減少，同時亦可激活機體免疫細胞進一步釋放免疫激活物，進而促使內皮功能發生異常［18］。在炎癥信號被激活的狀態下，機體血管細胞黏附分子-1以及黏附分子的表達水平亦會增加，同時整合素受體親和力上升后，其在血管內壁中的滾動將會受到一定抑制，在細胞趨化因子作用下進行遷移浸潤，進而導致內皮細胞功能損傷。正常組織中的NOD樣受體蛋白同樣參與了CMEC損傷過程，受缺血再灌注影響，CMEC的NOD樣受體蛋白水平增高，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（caspase-1）的活性上升，白細胞介素-1（IL-1）及IL-18表達水平明顯提高，誘發局部出現炎性反應，進而導致內皮細胞功能受損。原因可能與缺血再灌注期間的激活NOD樣受體蛋白相關。此外，在相同的體系中放入ROS清除劑之后，NOD樣受體蛋白與NLRP3炎癥小體之間的相互作用解除，且下游信號亦會明顯受到抑制，提示，ROS亦可能是激活NLRP3炎癥小體上游信號。此外，有關研究發現，在心肌細胞中很少出現NLRP3蛋白表達，但其在CMEC中存在表達，這亦進一步說明，NLRP3炎癥小體在CMEC病理的發生、發展中發揮了關鍵作用［19］。

CMEC的提取和鑒定

現階段有關CMEC的相關研究多選擇大鼠原代CMEC作為研究對象，但原代CMEC的培養、純化以及分離等相關實驗步驟的難度相對較大，且分離期間常會引入平滑肌細胞、纖維細胞等雜細胞，同時在傳代期間亦會喪失細胞的部分特性，導致細胞活性及純度下降，進而導致關于CMEC的研究難度受到極大限制［20］。而隨著醫學技術的不斷發展與進步，關于CMEC分離純化的研究取得了巨大進步，現階段已有包括磁珠、組織塊貼壁以及雙酶消化法3種分離法。而關于CMEC的鑒定主要包括標志物鑒定以及形態鑒定。

總結與展望

隨著對CMEC的持續研究，關于CMEC相關的病理分子機制已逐漸得以揭示，本研究綜述了關于CMEC功能障礙的相關研究進展，其中包括衰老、代謝、ROS、NOS以及炎癥等信號傳導，其涉及的相關分子機制較為復雜，但就目前相關研究可知ROS處于CMEC損傷的核心區域，在高糖、缺血、高血壓以及高游離脂肪酸所誘發的細胞損傷中，雖然觸發多種信號通路，促使細胞凋亡、NOS的活性降低、代謝異常等細胞表現，但究其根本均ROS的大量積累發揮了極為重要的作用。目前已闡明部分有關ROS與CMEC損傷的信號通路，但具體機制及因果關系還需對其進一步研究，但ROS在CMEC中發揮的功能是可以確定的。此外，雖然已有部分保護CMEC功能的相關藥物研究，但針對CMEC干涉藥物直接轉化至臨床應用的相關報道較少，有關上述診斷及相關治療的問題仍是今后需要研究的重點。冠狀動脈微血管疾病的發病機制較為復雜，其涉及眾多組織及細胞，除CMEC外，心肌細胞、血管平滑肌細胞以及免疫細胞等均參與了冠狀動脈微血管疾病的發生與發展。本研究僅綜述了部分CMEC損傷的相關分子機制，而了解冠狀動脈微血管疾病還需今后更為全面進行解析各種細胞信號傳導以及組織之間的交叉對話。隨著醫學水平的不斷發展及分子生物學技術持續進步，相信關于冠狀動脈微血管疾病的問題將會被逐漸揭示。