中藥材大薊及混偽品的傅里葉變換紅外光譜鑒別研究

單圣男，解玫瑩，王蘭，魏夢凌，劉想晴，程旺興*（1.安徽中醫藥大學藥學院，合肥20012；2.安徽省中醫藥科學院中藥資源保護與開發研究所，合肥 20012；.安徽中醫藥高等?？茖W校藥學系，安徽 蕪湖241002）

我國的中藥資源種類豐富多樣，且中藥材根源繁雜，為了確保中藥在臨床使用的有效性和安全性，對中藥進行鑒別和質量控制十分重要。大薊為菊科植物薊（Cirsium japonicumFisch.ex DC.）的干燥地上部分，味甘、苦，性涼，具有涼血止血、散瘀解毒消癰的功效[1]。現代藥理學表明大薊具有凝血止血、降血壓、抗腫瘤、抗骨質疏松、抗糖尿病、抑菌等藥理活性[2-5]。大薊的化學成分復雜多樣，主要有黃酮及黃酮苷類、長鏈烯炔醇類、木脂素類、甾醇類和揮發油類等。研究表明，蒙花苷和柳穿魚葉苷等成分是大薊發揮凝血止血作用的主要活性物質[6]。大薊在我國分布廣泛，以江蘇、浙江、四川分布最多[7]。大薊既是傳統中藥，又是現代臨床常用中藥；市場上存在著大薊的野生品、栽培品以及部分偽品，目前市場上主要的大薊混偽品有大薊同科同屬的小薊及同科不同屬的奶薊草等；薊屬植物在形態上具有很高的相似性，《中國藥典》對大薊的性狀描述也僅以營養期為主，使得大薊的鑒定困難；正品、偽品兩者的功效不同，若混淆使用，會直接影響用藥安全。因此對大薊的真偽鑒別顯得尤為重要。

常見的真偽鑒別有性狀特征鑒別、顯微鑒別、理化鑒別、分子鑒別等方法[8]。性狀鑒別雖過程簡單，成本低廉，但主觀和經驗主義色彩較濃，會導致通過量低或者結果無法量化，對鑒定結果會有影響。顯微鑒別從細微結構進行分析，雖彌補了性狀鑒別的不足，但由于植物組織特征的相似性高[9]，憑借顯微解剖特征難以解決近緣種藥材的鑒定問題。理化鑒別既定性又定量，是評價藥材真偽性的特定標準指標，但由于目前中藥大多數有效成分不明確，且并非單一成分，因此難以規定一個合理的數值標準，藥典中尚有許多藥材無定量指標。與傳統方法相比，DNA 分子遺傳標記技術能直接分析生物的基因型，且這種方式用量非常少，但目前絕大多數動植物的DNA 序列尚未明確，加上提取的技術煩瑣和相關試驗的周期長，操作較為困難[10]。傅里葉變換紅外光譜法（FT-IR）與傳統鑒別方法相比具有快速、無損、易于處理、信噪比高、重復性好等特點[11]，廣泛應用于鑒別食品、中草藥等混合體系[12]，中藥種類不同，其組成的化學物質存在一定差異，運用適當的化學前處理，就能得到含有不同化學組成的混合物[13]，使得中藥材在化學物質上的差別或不同表現在紅外光譜上，從而達到鑒別中藥材的目的。而將不同中藥材反映在紅外圖譜的差異特征轉化為可用計算機進行數值分析的量化特征，再用數理統計方法進行分析，即可使紅外光譜的應用向定量鑒別方向更進一步[14]。采用FT-IR 法對大薊和易混偽品進行鑒定的研究目前尚未見報道，本研究采用FT-IR 法對大薊及其混偽品進行鑒別，初步建立大薊藥材的真偽鑒別和質量評價方法。

1 儀器與試藥

Nicolet iN10 MX 傅里葉變換紅外光譜儀、DTGS 檢測器（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；SMART ITR 附件（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；BJ-150 型高速多功能粉碎機（合肥億心程試驗設備有限公司）。無水乙醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

藥材樣品來源如表1 所示，將39 批樣品放入烘箱中干燥，置于打粉機中進行粉碎，80 目篩過篩，備用。藥材均由安徽中醫藥大學楊青山老師鑒定，所收集樣品分別為菊科植物大薊、小薊和奶薊草。

表1 樣品信息Tab 1 Sample information

2 方法

2.1 原始紅外光譜的獲取

取少量樣品粉末，置于SMART ITR 附件的金剛石表面，攤平，旋轉附件旋鈕將樣品固定并壓成透明薄片。掃描波數為4000 ～500 cm－1，每次試驗對樣品粉末進行16 次掃描累加，掃描分辨率為4 cm－1，掃描過程中實時扣除二氧化碳和水蒸氣的干擾，得到相應的紅外光譜圖及試驗數據。

2.2 原始紅外光譜圖的預處理

樣品的原始紅外光譜圖夾雜著儀器噪音和一些無效信息，會導致分析結果的準確性和精密度下降，所以應對原始圖譜進行預處理，來減少各種干擾的影響。利用儀器自帶的OMNIC 9.0 分析軟件，對采集的紅外光譜圖進行光滑處理、自動基線校正和縱坐標歸一化處理得到標準圖譜。

2.3 精密度試驗

樣品連續測定5 次，得到紅外光譜圖并計算特征峰波數值RSD，結果顯示各特征峰波數值RSD均小于1.4%，表明儀器精密度良好。

2.4 穩定性試驗

樣品每隔30 min 進行一次光譜采集，測定5次，得到紅外光譜圖并計算特征峰波數值RSD，結果顯示各特征峰波數值RSD均小于2.6%，表明該方法的穩定性較好。

2.5 重復性試驗

將樣品平行制備5 份，分別測定，得到紅外光譜圖并計算特征峰波數值RSD，結果顯示各特征峰波數值RSD均小于2.4%，表明方法重復性良好。

3 方法與結果

3.1 大薊與混偽品的原始紅外光譜圖

圖1 中A、B、C 為39 批樣品經光滑處理、自動基線校正和坐標歸一化后的紅外圖譜，從圖中可以看出，同一中藥材紅外光譜圖的峰形相似。

圖1 大薊及混偽品的紅外光譜匯總圖Fig 1 Infrared spectrum summary of Cirsium japonicum and its adulterants

3.2 大薊與混偽品的紅外光譜圖

圖2 為奶薊草、小薊和大薊的紅外光譜圖，大薊及其混偽品的紅外光譜圖出現多個吸收峰，整體上基本相似，主要吸收峰在3340 ～3270、2890、1705、1025、860 cm－1左右，吸收峰在1800 ～500 cm－1內較為密集。3350 ～3250 cm－1頻率低譜帶寬的吸收峰推測是由氨基（—NH2）和羥基（—OH）的締合伸縮振動引起；2975 ～2887 cm－1的吸收峰推測為烷烴C-H 伸縮振動；2135 cm－1附近為C ≡C 鍵，1725 ～1704 cm－1附近的吸收峰推測為苯環的碳骨架伸縮振動及C ≡N、C ＝O 等伸縮振動[15]；1600 ～1574 cm－1為酰胺Ⅱ帶特征吸收峰；1051 ～1024 cm－1為C-O 鍵伸縮振動；884 ～859 cm－1處推測為＝CH 的面外彎曲振動吸收峰，636、637 cm－1為糖環骨架振動的指紋特征峰[16]?？梢钥闯銎渲袠悠返奈辗宓奈恢煤蛷姸染哂幸欢ǖ牟町愋?。

圖2 大薊及混偽品的紅外光譜圖Fig 2 Infrared spectra of Cirsium japonicum and its adulterants

通過對藥材樣品的紅外光譜圖分析，其主要特征為：奶薊草樣品在4000 ～1800 cm－1內只出現了3 個吸收峰，且在2890 cm－1和2823 cm－1處為2 個尖峰，在2500 ～1750 cm－1處相對平緩，無C ≡C 鍵，由此可以與大薊、小薊區分。小薊在2897 cm－1附近僅有1 個吸收峰，且在1250 cm－1附近出現多個明顯的小峰。大薊樣品的紅外光譜與偽品相比整體紅移30 個波數左右，可作為這3 種藥材的初步判斷依據。

3.3 大薊及混偽品的二階導數紅外光譜

大薊與混偽品的紅外光譜圖具有一定的差別，利用二階導數紅外光譜圖可以提高譜圖的分辨率，采用二階導對大薊、小薊和奶薊草的紅外光譜圖進行分析，可以使吸收峰的寬度變為原始寬度的1/3，從而很好地將原始圖形中重疊的峰分離，采用Origin 進行二階導，Savitsky-Golay 卷曲平滑法處理，得到特征峰明顯、噪音小的二階導圖譜，進而對3 種藥材的圖譜做進一步的觀察；在紅外圖譜中，由于在1800 cm－1之前會受—OH 的影響，而800 cm－1之后基線漂移過大[17]，因此選擇1800 ～800 cm－1進行二階導處理。

大薊與偽品在1800 ～800 cm－1處的二階導數紅外光譜圖見圖3，三者峰形和峰強均有明顯差異，可用于鑒別。在1800 ～1300 cm－1和1200 ～800 cm－1處可以觀察到3 種中藥材在二階導圖譜上的區別：區域1 中，奶薊草的吸收峰明顯比大薊、小薊吸收峰強，且在區域2 中有3個明顯向上的鋸齒峰；小薊與奶薊草在區域3 處的峰形不同，小薊有2 個向上鋸齒峰，且在區域5 中的吸收峰更強；從區域4 和6 中可以看出在此范圍內大薊的吸收峰相對其他圖譜紅移，且在1800 ～800 cm－1處的吸收峰相對平緩。

圖3 大薊及混偽品的二階導圖譜Fig 3 Second order guide map of Cirsium japonicum and its adulterants

3.4 大薊及混偽品的相似度分析

采用IBM SPSS26.0 統計對不同產地的大薊進行相似度分析，結果見表2；20 批大薊的相似度均在0.89 以上；大薊與小薊、奶薊草藥材進行相似度分析，結果見表3，可以看出，大薊與奶薊草和小薊的相似度分別為0.421 和0.773，奶薊草與小薊的相似度為0.717；由此可知，不同產地大薊的相似度均高于大薊與奶薊草或小薊的相似度，可根據相似度對大薊與偽品進行區分；其中大薊和奶薊草相似度較低，提示大薊和奶薊草的化學成分存在明顯差異。

表2 大薊相似度結果Tab 2 Similarity of Cirsium japonicum

表3 大薊及混偽品的相似度結果Tab 3 Similarity of Cirsium japonicum and its adulterants

3.5 大薊及混偽品的聚類分析模型的建立

使用SPSS 26.0 對樣品的紅外光譜圖進行聚類分析，結果見圖4；從圖中可知，在歐氏距離為20 時，39 批樣品被分為兩類，大薊單獨聚為一類，小薊和奶薊草聚為一類；當歐氏距離為10 時，可將大薊與混偽品分為3 類，奶薊草聚為一類，小薊聚為一類，大薊聚為一類；當歐式距離為3 時，小薊樣品具有明顯的地域傾向，同一產地的藥材聚類時距離較近。

圖4 大薊及混偽品的聚類分析圖Fig 4 Cluster analysis of Cirsium japonicum and its adulterants

3.6 大薊及混偽品的主成分分析

采用PCA 法對大薊及易混偽品的FT-IR 圖進行主成分分析，選取紅外光譜在1800 ～800 cm－1內的數據，利用Origin 軟件處理，得出主成分分析結果，根據特征值≥1 的原則[18]，確定2 個主成分，結果見表4。主成分1（PC1）的貢獻率為94.25%，主成分2（PC2）的貢獻率為4.28%，前2 個主成分PC1 和PC2 可以解釋原變量98.53%的信息。即選取前2 個主成分PC1 和PC2 繪制得分圖，見圖5，橫坐標代表主成分1（PC1）的得分值，縱坐標代表主成分2（PC2）的得分值，非常直觀地觀察到各類樣本在主成分空間的分布情況。

圖5 大薊及混偽品的主成分分析圖Fig 5 Principal component analysis of Cirsium japonicum and its adulterants

表4 大薊及混偽品的主成分分析表Tab 4 Principal component analysis of Cirsium japonicum and its adulterants

由圖5 可知，大薊和奶薊草明顯集中地聚為單獨的兩組，組間互不交叉，大薊主成分1 和2得分散點全部集中在第四象限，奶薊草主成分1和2 得分散點全部集中在第三象限，小薊主成分1 和2 得分散點分布在第二象限，表明大薊和奶薊草在主成分空間圖中載荷量有顯著差異。小薊分布較為分散，可能是不同產地的小薊質量存在差異，該結果與聚類分析結果一致。

3.7 簇類獨立軟模式法（SIMCA）分類模型的建立與鑒別分析

通過PCA 分析大薊與混偽品有明顯的聚類趨勢，因此建立大薊、小薊與奶薊草的分類識別模型，在PCA 分析的基礎上，39 批樣品中隨機選擇15 個大薊、11 個小薊和3 個奶薊草組成訓練集，其余5 個大薊，3 個小薊和2 個奶薊草作為驗證集，建立SIMCA 分類模型；模型效果用識別率和拒絕率表示，識別率是指某類樣品有多少落在該模型的區域內，而拒絕率是指某類樣品模型對于不屬于該類的位置樣品的拒絕程度[19]。從表5 中可以看出，在訓練集中大薊和奶薊草SIMCA 分類模型對樣本的識別正確率為100%，小薊模型對樣本的識別率為90.91%，大薊的拒絕率為92.86%，有1 個小薊樣品落在了大薊模型范圍內，使該模型出現了誤判；在驗證集中大薊與奶薊草模型、小薊模型的識別率、拒絕率均為100%。SIMCA 分類模型聚類分析圖見圖6，大薊與混偽品具有較高的獨立性，基本實現完全分割。一般來說，SIMCA 分類模型的正確識別率在60%以上，說明該模型可行[20]。因此，本研究建立的大薊及混偽品的SIMCA 分類識別模型可行。

圖6 大薊及混偽品訓練集（A）和驗證集（B）的SIMCA 模式聚類圖Fig 6 SIMCA pattern clustering diagram of Cirsium japonicum and its adulterants training（A）andverification（B）set samples

表5 SIMCA 模式的訓練集與驗證集結果Tab 5 Training set and verification set of SIMCA mode

4 討論

本研究選取大薊及混偽品小薊、奶薊草作為研究對象，對其進行鑒別研究，建立了一種方便、快捷、無損害的鑒別方法。在對紅外光譜圖的分析中發現，由于樣品屬于近緣物種，化學結構和化學組成都比較相似，因此原譜圖之間的差異不是很明顯；對紅外圖譜選取1800 ～800 cm－1進行二階導處理和相似度分析，能將大薊、小薊和奶薊草區分。本研究采用了FT-IR 技術結合聚類分析和SIMCA 分類模式對39 批大薊及其混偽品進行分析研究，較好地實現了大薊與小薊、奶薊草之間的分類鑒定。該方法避免了復雜的樣品前處理過程，具有方便、快捷、準確等優點，有一定的可靠性和實用性，為大薊及其混偽品的鑒別與質量研究提供了科學理論依據，具有廣闊的應用前景。