苯并芘促進FHIT、CDH13基因啟動子區甲基化及機制研究

武岳，張夢迪，李君，王冬雪，白圖雅，呂曉麗，胡玉霞，高峰，周樹宏，李京慧，范興業，常福厚，王光*（.內蒙古醫科大學附屬醫院，呼和浩特 0000；.內蒙古醫科大學藥學院，呼和浩特 000；3.內蒙古醫科大學新藥安全評價研究中心，呼和浩特 000；4.內蒙古自治區新藥篩選工程研究中心，呼和浩特 000；5.內蒙古醫科大學基礎醫學院，呼和浩特 000；6.上海中醫藥大學交叉科學研究院，上海 00）

肝癌是世界上常見的惡性腫瘤之一，我國肝癌的發病率和病死率均居世界首位[1]。肝癌的發生也和其他腫瘤一樣是環境因素和遺傳因素共同作用的結果，已有研究表明腫瘤相關基因啟動子異常甲基化可以作為腫瘤發生的敏感生物標志物[2-3]。

DNA 甲基化為DNA 化學修飾的一種形式，能夠在不改變DNA 序列的前提下，改變遺傳表現。脆性組氨酸三聯體（fragile histidinetriad，FHIT）基因是一個抑癌基因[4]。T-鈣黏蛋白（T-cadherin/H-cadherin，CDH13）是非典型的鈣黏素家族中的一員[5]。研究表明FHIT、CDH13可能成為惡性腫瘤風險評估和監測預后的新的分子生物學標志物[6]。此外，本課題組前期研究發現FHIT、CDH13基因甲基化在肝癌患者中高表達，提示FHIT、CDH13基因甲基化可能與肝癌的發生發展關系密切[7]。

苯并芘[benzo(a)pyrene，BaP]是一種常見的環境污染物。在流行病學研究中，環境中高水平的BaP 暴露會增加肝細胞癌（human hepatocellular carcinoma，HCC）的風險，表明BaP 可能是誘發HCC 的原因之一[8]。但是關于BaP 作用于HepG2細胞對FHIT、CDH13基因啟動子區甲基化的影響尚未見報道。本研究選取DNA 甲基轉移酶抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-Aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-CdR）作為陽性對照，通過MSP 法檢測BaP 對FHIT、CDH13基因甲基化的情況，同時采用RT-qPCR 和Western blot 法檢測BaP 對FHIT、CDH13、DNMT1、Sp1 mRNA 和蛋白表達的影響并對其機制進行初步探討，為肝癌分子標記物的篩選及致癌機制的探討提供參考。

1 材料

BaP（美國Sigma 公司），DMEM 高糖培養基、胎牛血清（美國Gibco 公司），DNA 提取酚試劑（中國Solarbio 公司），5-Aza-CdR（中國上海源葉公司），EZ DNA Methylation-Gold 試劑盒（中國南京博爾迪生物有限公司），甲基化特異性PCR 試劑盒（中國天根生化科技有限公司），FHIT、CDH13、DNMT1、Sp1 和β-actin 兔單克隆抗體（英國Abcam 公司），RevertTra Ace qPCR RT kit、SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒（日本TOYOBO 公司）。人肝癌細胞株HepG2（北京協和基礎醫學研究所）。

2 方法

2.1 細胞培養及處理

人肝癌HepG2 細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM 培養基中，置于含5% CO2的37℃培養箱中常規培養，倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，當細胞達到80%～90%融合時，胰蛋白酶消化制成細胞懸液后以適當的密度接種于細胞培養6 孔板中并搖勻。選取DNA 甲基轉移酶抑制劑5-Aza-CdR 作為陽性對照組，實驗分為對照組、陽性對照組及不同濃度BaP（0.1、1、10 μmol·L－1）組。分別用0.1、1、10 μmol·L－1BaP，5-Aza-CdR 處理細胞24 h，對照組不加任何藥物處理。然后收集細胞進行下一步的檢測實驗。

2.2 甲基化特異性PCR（MSP）法檢測FHIT、CDH13 基因甲基化情況

采用酚氯仿法提取DNA，根據DNA Methylation-Gold 試劑盒說明書對DNA 進行甲基化修飾，并進行擴增，擴增引物見表1，PCR 條件如下：變性（95 ℃，5 min），退火（94℃ 20 s、64℃ 30 s、72 ℃ 20 s，35 個循環），延伸（72 ℃10 min）。PCR 產物在2%瓊脂糖凝膠中電泳分析，應用UVP 凝膠成像系統觀察電泳結果。

表1 MSP 中FHIT、CDH13 基因的引物序列、產物片段大小及退火溫度Tab 1 Primer sequences of FHIT and CDH13 genes in MSP，product fragment size and annealing temperature

2.3 熒光實時定量PCR（RT-qPCR）法檢測FHIT、CDH13、DNMT1、Sp1 mRNA 表達情況

將細胞按“2.1”項下方法處理后，收集細胞，按RNA 提取試劑盒提取細胞總RNA，使用Nanodrop2000 測定RNA 純度及濃度，根據反轉錄試劑盒說明書合成cDNA。引物序列見表2，使用RT-qPCR 法進行擴增，反應程序如下：95℃2 min，90℃ 20 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 50 s（40 個循環），采用2－△△CT法計算檢測基因mRNA 的相對表達量，實驗重復3 次。

表2 FHIT、CDH13、DNMT1 及Sp1 基因的引物序列Tab 2 Primer sequence of FHIT，CDH13，DNMT1，and Sp1 gene

2.4 Western blot 法檢測FHIT、CDH13、DNMT1、Sp1 蛋白表達情況

將細胞處理24 h 后，蛋白裂解液裂解細胞提取各組細胞總蛋白，BCA 法測定蛋白質濃度，定量后進行 SDS-PAGE 垂直電泳，濕法PVDF 轉膜，封閉液封閉20 min，在4℃下一抗（1∶5000）孵育過夜，TBST 清洗3 次，二抗避光孵育1 h，紅外熒光掃描成像系統檢測，掃描后應用Image J軟件進行分析。

2.5 統計分析

采用SPSS 22.0 對數據進行統計分析，計量資料組間差異采用單因素方差分析法進行檢驗，數據采用均數±標準差（±s）來表示，并采用Graphpad Prism 統計分析軟件作圖，P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 BaP 對FHIT、CDH13 基因甲基化的影響

FHIT基因擴增對接基因中原始序列的位置為：195—283（來自GenBank 序列號U76263），甲基化島5 個[9]。CDH13擴增對接基因中原始序列的位置為－265—－247，甲基化島6 個[10]。采用MSP 法檢測不同濃度的BaP（0、0.1、1、10 μmol·L－1）處理24 h 后的HepG2 細胞，結果顯示陽性對照組（5-Aza-CdR 組）中CDH13、FHIT基因呈現非甲基化狀態，隨著BaP 濃度增加，FHIT、CDH13基因甲基化條帶（M 條帶）亮度逐漸增強，而非甲基化條帶（U 條帶）亮度逐漸減弱，且均呈劑量依賴性，高劑量組呈現完全甲基化狀態（見圖1）。表明BaP可促進FHIT、CDH13基因啟動子區域的甲基化。

圖1 FHIT 基因（A）和CDH13 基因（B）MSP 電泳圖Fig 1 MSP electropherogram of FHIT genes (A) and CDH13 genes (B)

3.2 BaP 處理后FHIT、CDH13、DNMT1、Sp1 mRNA 表達情況

將對照組中FHIT、CDH13、DNMT1、Sp1mRNA 表達量設置為1，與對照組比較（見圖2），陽性對照組FHIT、CDH13、DNMT1、Sp1mRNA及BaP 1 μmol·L－1和10 μmol·L－1組中FHIT、CDH13、DNMT1、Sp1的表達差異均具有統計學意義（P＜0.05，P＜0.001）。結果表明BaP 中、高劑量組可以顯著下調FHIT、CDH13mRNA 表達量，而上調DNMT1、Sp1mRNA 表達量。

圖2 不同濃度BaP 處理后FHIT、CDH13、DNMT1 及Sp1 基因mRNA 表達的情況（n ＝3）Fig 2 mRNA expression of FHIT，CDH13，DNMT1 and Sp1 at different concentrations of BaP（n ＝3）

3.3 BaP 處理后FHIT、CDH13、DNMT1、Sp1 蛋白表達情況

與對照組相比，BaP 0.1 μmol·L－1蛋白表達雖降低，但差異無統計學意義（P＞0.05），陽性對照組表達顯著升高（P＜0.05）。BaP 1 μmol·L－1和10 μmol·L－1組較對照組FHIT、CDH13 蛋白表達顯著減低，而DNMT1、Sp1 蛋白表達顯著增加（見圖3）（P＜0.05）與RT-qPCR 結果一致。表明BaP 可能通過增加DNMT1、Sp1 蛋白表達而抑制FHIT、CDH13 蛋白表達。

圖3 不同濃度BaP 處理后FHIT、CDH13、DNMT1 及Sp1 基因蛋白表達的情況（n ＝3）Fig 3 Protein expression of FHIT，CDH13，DNMT1 and Sp1 at different concentrations of BaP（n ＝3）

4 討論

DNA 甲基化是重要的表觀遺傳修飾方式之一，參與調節胚胎發育、轉錄、染色質結構、X染色體失活、基因組印記和染色體穩定等多項生命活動[11]。近年來國內外學者對FHIT、CDH13基因甲基化與肝癌的關系進行了大量的研究，研究表明FHIT、CDH13基因甲基化與惡性腫瘤的發生發展密切相關[12]。此前，Tuoya 等[7]的實驗也證實了FHIT、CDH13基因在肝癌患者中呈現高甲基化狀態。BaP 是國際公認的環境污染物，被列為Ⅰ類致癌物，已有研究報道BaP 可以促進肝癌的發生和進展[13]，但其具體機制尚未清晰。Jiang 等[14]研究發現，BaP 誘導的DNA 甲基化改變可能會導致與空氣污染相關肺癌中異常的DNA 甲基化，這些DNA 甲基化改變可能影響肺癌的發生和進展。本實驗以DNA 甲基轉移酶抑制劑5-Aza-CdR 為陽性對照組，通過采用甲基化特異性PCR 法檢測不同濃度BaP 作用于HepG2細胞后FHIT、CDH13基因的甲基化情況，結果表明BaP 可增強FHIT、CDH13基因甲基化水平，且具有濃度依賴性，本實驗結果佐證了之前的研究內容也彌補了的BaP 對HepG2 細胞內的FHIT、CDH13甲基化水平的研究空白。

DNA 甲基化和去甲基化可通過DNA 甲基轉移酶（DNMT）進行調控，兩個 DNMT 家族 DNMT3和 DNMT1 分別負責甲基化的建立和維持[15]。Robert 等[16-17]研究發現DNMT1 和DNMT3b 協同作用抑制腫瘤的CpG 島高甲基化。DNMT1 負責將己經發生變化的基因DNA 甲基化信息傳遞于子代細胞，使得異常DNA 甲基化模式繼續發生和延續[18]。Leu 等[19]在卵巢癌的研究中，沉默DNMT1后3 個無活性TWIST、RASSF1A和HIN-1基因發生部分去甲基化，并恢復了基因的表達。本實驗結果發現隨著BaP 濃度的升高，DNMT1 的蛋白及mRNA 表達逐漸增加，高劑量組BaP 對DNMT1蛋白及mRNA 表達增加最為明顯，但抑癌基因FHIT、CDH13無論是蛋白表達還是mRNA 表達都逐漸減少，表明BaP 可能通過顯著增加甲基化轉移酶DNMT1 的活性使FHIT、CDH13表達減少，從而發揮促甲基化的作用。

DNMT1 活性的改變與其表達水平和功能性激活有關，其表達水平主要受核轉錄因子Sp1的調控。Song 等[20]研究發現DNA 甲基轉移酶DNMT1 與Sp1 結合并引起一些Sp1靶基因的抑制，同時Sp1 還可以通過與DNMT1 相互作用而促進特定位點的甲基化[21]。為了進一步探究BaP 抑制DNMT1 表達的機制，采用RT-qPCR、Western blot 法對其進行驗證，結果表明BaP 暴露后，細胞中Sp1mRNA 與蛋白表達均顯著增高。有研究指出對DNMT1 的表達抑制機制可能是通過抑制Sp1 的活性而實現的[22]。由于Sp1 在DNMT1 上有結合位點，所以BaP 可能通過上調Sp1 蛋白與mRNA 的表達發揮促進作用，可能最終會導致DNMT1 的活性增強，從而促進FHIT、CDH13基因甲基化作用。

綜上所述，本研究發現BaP 可能會通過增強Sp1 促進DNMT1 活性，調控FHIT、CDH13基因甲基化表達，影響FHIT、CDH13基因的表達水平，從而發揮促甲基化作用。但BaP 如何調控Sp1和DNMT1 及其下游信號通路有待進一步研究。