替諾福韋、依非韋倫對拉米夫定在大鼠體內藥動學的影響

余史丹，汪碩聞，唐原君，李紅霞，竺東杰，范國榮2，*（.聯勤保障部隊第906醫院藥劑科，浙江 寧波 5040；2.上海市藥物（中藥）代謝產物研究重點實驗室，上海 2004；.上海交通大學附屬第一人民醫院臨床藥學科，上海 200080）

獲得性免疫缺陷綜合征，簡稱艾滋病，是由人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染引起的一種嚴重威脅人類健康的傳染性疾病[1]。高效抗逆轉錄病毒治療法（highly active antiretroviral therapy，HAART）是現階段艾滋病治療最為有效的方法。國家推薦用于成人及青少年抗病毒治療的三聯療法一般包括兩種核苷類逆轉錄酶抑制劑（nucleoside reverse transcriptase inhibitors，NRTIs）和一種非核苷類逆轉錄酶抑制劑（non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors，NNRTIs）[2-3]。其中，富馬酸替諾福韋酯、拉米夫定聯合依非韋倫為目前臨床上推薦的初始抗病毒療法的首選方案，療效顯著、不良反應少[4-6]。富馬酸替諾福韋酯與拉米夫定同屬于核苷類逆轉錄酶抑制劑。富馬酸替諾福韋酯水溶性好，口服后水解生成替諾福韋，競爭性地結合逆轉錄酶從而抑制HIV 病毒復制[7]。拉米夫定口服吸收良好，代謝生成三磷酸拉米夫定，阻斷病毒DNA 鏈的合成和延長從而發揮抗病毒作用[8]。依非韋倫作為一種選擇性非核苷類逆轉錄酶抑制劑，對HIV-1逆轉錄酶產生非競爭性抑制作用，阻礙病毒復制而發揮療效[9]，三者聯用協同發揮抗病毒作用。

降低用藥劑量，減少不良反應發生率、增加依從性和降低耐藥的發生是目前艾滋病治療新方案的研究方向。本試驗研究的新型抗艾滋病復方藥物（拉米夫定300 mg ＋富馬酸替諾福韋酯200 mg ＋依非韋倫400 mg）是何志明院士團隊基于反饋系統控制平臺體系（Feedback System Control，FSC）對臨床常用的多種抗病毒藥物進行篩選、重組和劑量優化得到的高效、低毒的藥物組合[10]。與目前臨床上常用的一線治療方案（拉米夫定 300 mg ＋富馬酸替諾福韋酯300 mg ＋依非韋倫 600 mg）相比，組合相同，劑量較低，有利于減輕藥物不良反應，降低用藥成本，提高患者用藥依從性[11-13]。

藥物聯合使用常可達到增效減毒的目的，但也存在療效降低、毒副作用增強等風險，藥動學相互作用是導致其發生的重要機制之一[14-15]。已有研究報道聯用替諾福韋及地達諾新后拉米夫定的AUC0～∞保持不變，Cmax降低，tmax增加，但差異不具有統計學意義[16]。Jiang 等[17]對大鼠口服恩替卡韋和拉米夫定后拉米夫定的藥動學進行研究，未發現顯著藥物相互作用。Ceckova 等[18]研究發現聯用依非韋倫后拉米夫定的血漿清除率（CL）顯著降低，t1/2延長，AUC0～∞增加，減少了其在大鼠體內的腎臟排泄。目前拉米夫定聯用富馬酸替諾福韋酯、依非韋倫后是否存在藥動學相互作用尚未見相關報道。

本實驗建立了一種快速、靈敏的UFLC-MS/MS 法測定大鼠血漿中拉米夫定的濃度，并應用于研究新型抗艾滋病復方藥物中富馬酸替諾福韋酯、依非韋倫對拉米夫定在大鼠體內藥動學行為的影響，探討可能存在的藥動學相互作用，為抗病毒藥物臨床安全、合理使用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

SHIMADZU UFLC-20A（配備CBM-20A 控制器，DGU-20A3 在線脫氣機，LC-20AD 高壓梯度泵，SIL-20A 自動進樣器和CTO-20AC 柱溫箱，日本島津公司），API 4000 三重四級桿串聯質譜儀、Analyst 1.6 色譜質譜工作站（美國AB Sciex 公司），SCILOGEX MX-S 渦旋混合器（美國Scilogex 公司），SORVALL LEGEND Micro 21R 冷凍離心機（美國Thermo Scientific 公司），XS205 Dual Range 電子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO 公司），SK5200H超聲儀（上海科導超聲儀器有限公司），Hi-Tech 水純化系統（上海和泰儀器有限公司）。

1.2 試藥

替諾福韋對照品（含量＞99%，批號：MO426AS）、依非韋倫對照品（含量＞99%，批號：MO202AS）、拉米夫定對照品（含量＞99%，批號：MO222AS）、內標阿昔洛韋對照品（含量＞99%，批號：JO610AS）、富馬酸替諾福韋酯原料藥（含量＞98%，批號：MB1237）、依非韋侖原料藥（含量＞98%，批號：MB3218）、拉米夫定原料藥（含量＞98%，批號：MB1889）（大連美侖生物技術有限公司）。

甲醇（色譜純，德國Merck）；乙酸銨（分析純，上海泰坦化學有限公司）；甲酸（色譜純，上海安譜公司）；水為Hi-Tech 水純化系統自制的去離子超純水（18.2 MΩ）。

1.3 實驗動物

SPF 級成年、健康Sprague-Dawley 大鼠，180 ～220 g，雌雄兼顧[上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2013-0016]。所有的動物實驗均符合海軍軍醫大學動物倫理委員會規定。

2 方法與結果

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱Agilent ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×150 mm，5 μm），柱溫30℃，流動相A 為含0.1%甲酸和25 mmol·L－1乙酸銨的去離子水，流動相B 為甲醇，梯度洗脫（0.01 ～0.30 min，40% ～70%B；0.31 ～2.40 min，70%B；2.41 ～3.00 min，40%B）；流速1 mL·min－1，柱后分流比3∶7，進樣量5 μL，分析時間3 min。

2.1.2 質譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），正離子檢測模式，選擇多反應監測（MRM）方式進行一/二級質譜分析。源參數：源電壓5500 V，Gas1 50 psi，Gas2 45 psi，CUR 20 psi，CAD 10 psi，離子源溫度500℃；各化合物的一/二級離子和質譜特征性參數見表1，二級質譜圖見圖1。

圖1 各分析物及內標的離子質譜圖Fig 1 Product ion mass spectra of each analyte and the internal standard

表1 各分析物及內標用于定量分析的離子通道及優化后的質譜參數Tab 1 Mass parameters and MRM transitions optimized for quantitative analysis of each analyte and the internal standard

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液的配制 精密稱取拉米夫定對照品約10 mg，置于10 mL 棕色量瓶中，加入50%甲醇配制成質量濃度為1 mg·mL－1的儲備液。將儲備液用50%甲醇溶液逐級稀釋得到拉米夫定質量濃度分別為100、200、500、1000、5000、10 000、18 000、20 000 ng·mL－1的系列工作溶液，同法配制含拉米夫定質量濃度為300、2500 和16 000 ng·mL－1的質控工作溶液。

2.2.2 內標阿昔洛韋溶液的配制 精密稱取阿昔洛韋對照品約10 mg，置于10 mL 量瓶中，加50%甲醇溶解并定容，得質量濃度為1 mg·mL－1的標準儲備液。用50%甲醇水溶液稀釋后得質量濃度為1000 ng·mL－1的內標阿昔洛韋工作溶液。以上所有溶液均置于－20℃保存。

2.3 血漿樣品的前處理

血漿樣品采用96 孔板（美國Waters）蛋白沉淀高通量前處理方法。每一批次分析樣品隨行標準曲線的配制，質控樣品和實測樣品的加樣均在同一塊96孔板上完成。采用自動多通道移液器（瑞士INTEGRA）在孔內準確加入50 μL 血漿、5 μL內標阿昔洛韋溶液（1000 ng·mL－1）和150 μL 甲醇進行蛋白沉淀，96 孔板封蓋并渦旋振蕩3 min，置于正壓裝置（美國Waters）下濾過提取5 min，隨后移取濾液至進樣小瓶中，自動進樣5 μL 進行UFLC-MS/MS 分析，峰面積內標法定量檢測。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性實驗 通過對6 批不同來源SD 大鼠空白血漿、空白血漿標準添加定量下限（lower limit of quantitation，LLOQ）濃度水平標準溶液、實測血漿樣品進行比較以考察方法的專屬性。結果SD 大鼠血漿樣品中拉米夫定及內標阿昔洛韋的保留時間分別為2.20、1.95 min，血漿內源性及其他物質對分析物及內標的測定無明顯干擾，如圖2 所示，表明該方法專屬性良好。

圖2 大鼠血漿中拉米夫定及內標阿昔洛韋的典型圖譜Fig 2 Representative MRM chromatogram of lamivudine and the internal standard in the rat plasma

2.4.2 LLOQ 和線性范圍 精密吸取拉米夫定工作溶液5 μL，加入SD 大鼠空白血漿45 μL，配制成含拉米夫定約10、20、50、100、500、1000、1800 和2000 ng·mL－1的血漿樣品，按“2.3”項下方法操作，進樣分析。以分析物與內標的峰面積比值（Y）對相應的質量濃度（X）進行加權（1/χ2）線性回歸，得拉米夫定的標準曲線方程為Y＝0.0271X＋0.0528（r＝0.9995）。結果表明，SD 大鼠血漿中拉米夫定在10.26 ～2052 ng·mL－1與峰面積線性關系良好，LLOQ 為10.26 ng·mL－1（S/N＞10）。

2.4.3 精密度和準確度實驗 配制含拉米夫定的LLOQ 樣品和低、中、高3 個濃度水平的質控樣品（每一濃度平行配制6 份），按“2.3”項下方法處理后進樣分析，連續3 d 分別進樣3 個分析批進行測定。根據當日建立的標準曲線分析LLOQ樣品和質控樣品，將測得濃度與理論濃度比較，計算準確度及日內、日間精密度。結果顯示，拉米夫定日內、日間精密度RSD均小于10%，準確度為92.23%～103.10%，表明該方法準確、可靠，且重復性好，結果見表2。

表2 SD 大鼠血漿中拉米夫定的日內、日間精密度及準確度Tab 2 Precision and accuracy of lamivudine in SD rat plasma

2.4.4 回收率及基質效應 配制含拉米夫定低、中、高3 個濃度水平的質控樣品（每一濃度平行配制6 份），按“2.3”項下方法處理，進樣檢測得峰面積A；另取6 批不同來源的SD 大鼠空白血漿樣品，按“2.3”項下方法加入沉淀劑制備空白基質上清液，加入相應濃度的質控工作溶液（每批次每一濃度平行配制3 份，共6 批），進樣分析得峰面積B；直接進樣分析相應濃度的質控工作溶液得峰面積C；按A/B×100%計算各濃度水平下拉米夫定及內標阿昔洛韋的提取回收率，按B/C×100%計算各濃度水平下拉米夫定及內標阿昔洛韋的基質基質因子，進一步計算得經內標歸一化的基質因子，結果見表3。拉米夫定在低、中、高3 個質控濃度下的回收率及基質效應均較一致。

表3 SD 大鼠血漿中拉米夫定及內標阿昔洛韋的回收率和基質效應Tab 3 Recovery and matrix effect of lamivudine and IS in SD rat plasma

2.4.5 稀釋效應 配制含拉米夫定質量濃度為3200、8000、16 000 和32 000 ng·mL－1的SD大鼠血漿質控樣品各5 份，分別用空白血漿稀釋2、5、10 和20 倍，按“2.3”項下方法處理后進行UFLC-MS/MS 分析。結果顯示，血漿稀釋2、5、10、20 倍后測得值與理論值的平均相對誤差（RE）分別為0.70%、1.74%、2.33%和2.53%，RSD值均小于5%，表明高質量濃度血漿樣品經稀釋后不影響測定。

2.4.6 殘留 配制標準添加定量上限（upper limit of quantification，ULOQ）質量濃度（2000 ng·mL－1）水平的血漿樣品，按“2.3”項下方法處理后進樣分析。通過進樣標準添加ULOQ 水平的血漿樣品后，緊接著連續進樣空白溶劑估計殘留。結果表明，在該分析方法下，空白溶劑中拉米夫定峰面積與相應分析批ULOQ 峰面積之比均小于15%，且不超過內標的1.5%。

2.4.7 交叉串擾 吸取拉米夫定儲備液適量，用50%甲醇稀釋制得其ULOQ 溶液（2000 ng·mL－1）。取水代空白血漿50 μL，按“2.3”項下方法制備不含內標的ULOQ 樣品及僅含內標的IS 樣品。結果表明，拉米夫定、內標各通道間無交叉串擾，如圖3 所示。

圖3 拉米夫定及內標阿昔洛韋的典型圖譜Fig 3 Representative MRM chromatogram of lamivudine and acyclovir（IS）

2.4.8 穩定性 配制低、高質量濃度（30、1600 ng·mL－1）的拉米夫定血漿標準樣品，按“2.3”項下方法操作處理后進樣分析，考察樣品處理、進樣分析及儲存過程中的穩定性。含拉米夫定的血漿樣品室溫下放置4 h 穩定，RE為－3.37%～6.44%，RSD＜2.3%；處理后樣品在自動進樣器中放置12 h穩定，RE為－1.57%～7.21%，RSD＜4.6%；樣品經三次凍融循環（－80℃）后穩定，RE為－2.22%～10.61%，RSD均＜3.2%；樣品在－80℃冰箱冷凍保存60 d 后穩定，RE為－1.26%～3.17%，RSD均＜0.87%。結果表明，拉米夫定血漿樣品在樣品處理、分析及儲存過程中穩定性良好。

2.5 藥動學研究

選用12 只成年、健康SD 大鼠，雌雄各半，隨機分為單獨給藥組和聯合給藥組。禁食過夜后，分別灌胃給藥拉米夫定32 mg·kg－1，拉米夫定32 mg·kg－1＋富馬酸替諾福韋酯21 mg·kg－1＋依非韋倫43 mg·kg－1（等效劑量通過體表面積法換算而得），于給藥前（空白對照）及給藥后5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h 從大鼠眼眶取血300 μL 置于涂有肝素的EP 管中，6500 r·min－1離心5 min，取上清液置于－80 ℃冰箱保存。血漿樣品按“2.3”項下方法處理后進行UFLC-MS/MS分析。以非房室模型（統計矩法）經DAS 2.0 軟件計算藥動學參數。采用獨立樣本t檢驗對藥動學參數進行統計學分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。平均血藥濃度-時間曲線見圖4，藥動學參數見表4。

表4 SD 大鼠單獨給藥和聯合給藥后拉米夫定的藥動學參數Tab 4 Pharmacokinetic parameters of lamivudine in SD rats after a single and combination administration

圖4 SD 大鼠單獨給藥和聯合給藥后血漿中拉米夫定的平均藥-時曲線Fig 4 Mean plasma concentration-time curves of lamivudine in SD rat plasma after a single and combination administration

從表4 中可以看出，單獨給藥組和聯合給藥組大鼠血漿中拉米夫定均于給藥后1 h 達峰，Cmax分別 為4178.95 ng·mL－1和4598.86 ng·mL－1，AUC0～τ分別為14 917.86 ng·h·mL－1和13 728.50 ng·h·mL－1，t1/2z分別為1.50 h 和1.63 h，P值均大于0.05，藥動學參數變化差異無統計學意義，提示聯合使用替諾福韋與依非韋倫對拉米夫定在大鼠體內的藥動學行為無明顯影響。

3 討論

文獻報道生物基質中拉米夫定的測定多采用高效液相色譜法（HPLC-UV）、液相色譜-質譜串聯法（LC-MS/MS）等，存在靈敏度低[19]、血漿用量大[20-21]、樣品前處理過程煩瑣[22-23]、分析時間長[24-25]等局限。本實驗建立了一種快速、簡便、專屬性好的UFLC-MS/MS 方法測定大鼠血漿中拉米夫定的濃度，分析時間僅為3 min，分析過程中血漿用量少，僅需50 μL。通過考察不同有機溶劑（甲醇、乙腈），分別按1∶2、1∶3、1∶5（血漿樣品∶有機溶劑）沉淀蛋白處理，結果表明使用甲醇1∶3沉淀蛋白時，拉米夫定的色譜峰峰形良好，基質干擾小，靈敏度及回收率等均符合分析要求。同時采用96孔板系統對血漿樣品進行蛋白沉淀處理，顯著縮短了樣品處理時間，提高了樣品處理效率，實現了大規模樣品的高通量分析。

本研究首次考察了富馬酸替諾福韋酯、依非韋倫對拉米夫定在大鼠體內藥動學過程的影響。結果表明，聯用替諾福韋、依非韋倫使拉米夫定的Cmax、CL增加，AUC0～∞減少，但差異無統計學意義（P＞0.05），提示無顯著藥動學相互作用存在。拉米夫定主要以原形藥物由腎小球濾過、腎小管分泌排泄，部分通過有機陽離子轉運系統經腎臟排出，約占其總清除量的70%[26]。作為轉運體OCT2、MATE1 和MATE2-K 的底物，當與此類轉運體抑制劑聯用時可降低拉米夫定的腎臟清除率[27-28]。替諾福韋系統代謝極少，主要通過腎小球濾過及活性小管分泌（OAT1 和OAT3 轉運至基底膜腎小管上皮細胞，由MRP4 分泌至腎小管管腔）聯合作用排泄[29-30]。盡管替諾福韋、拉米夫定均主要經腎臟消除，但本研究結果提示無顯著藥動學相互作用存在，與Kearney 等[16]報道的研究結果一致，分析原因可能與其排泄過程中的藥物轉運蛋白不同有關。研究報道，一定濃度的依非韋倫可通過抑制MATE1、OCT1、OCT2 和MRP2 轉運體而減少拉米夫定在大鼠腎臟中的排泄[18]，但在本研究中未觀察到拉米夫定CL、t1/2、AUC0～∞等藥動學參數的顯著變化，考慮與本實驗中給藥劑量較低（依非韋倫 400 mg）有關，需進一步探究。拉米夫定、富馬酸替諾福韋酯及依非韋倫聯合用于艾滋病抗病毒治療，臨床上需長期給藥[31]。本實驗僅考察了單劑量富馬酸替諾福韋酯、依非韋倫對拉米夫定的影響，具有一定的局限性，針對多劑量富馬酸替諾福韋酯、依非韋倫對拉米夫定藥動學影響及其具體作用機制有待后續進一步研究。