美麗薄子木內生真菌Rhytidhysteron sp.BZM-9化學成分研究

張莎，曠敏，彭偉偉，鄭雨婷，許立，曾廣源，鄒振興*（1.中南大學湘雅藥學院，長沙 410013；2.慢病診療小分子藥物發現與轉化湖南省重點實驗室，長沙 410013）

植物內生真菌是天然產物的重要資源，它們棲息在宿主植物的不同器官、組織內，對宿主植物本身不會引起任何疾病[1]。從微生物，尤其是植物內生真菌和海洋微生物中尋找和發現活性新穎的先導化合物已成為當前的研究熱點[2-3]。近年來，內生真菌產生的多種生物活性代謝物具有重要的社會經濟價值，在農業（作為生物肥料/生物刺激劑）和環境（生物修復）中被廣泛應用[2]。

美麗薄子木（Leptospermum brachyandrum）為桃金娘科（Myrtaceae）魚柳梅屬（Leptospermum）小喬木或灌木，原產于澳大利亞。由于其觀賞及藥用價值引入我國，目前在廣東、廣西等地廣泛種植。研究顯示，桃金娘科植株富含精油及間苯三酚類成分，具有較好的抗菌活性[4-8]。但目前國內外關于該科植物美麗薄子木的化學成分及其內生真菌的研究鮮少。課題組前期通過組織分離法從美麗薄子木植物中分離出一株內生真菌，經ITS測序鑒定為Rhytidhysteronsp.BZM-9。經文獻檢索發現，目前國內外對于該屬真菌的化學成分研究較少，僅報道幾個色原酮[9]及螺二萘成分[10-12]。因此，為了進一步探明其化學多樣性，本文利用現代色譜及光譜技術從中分離鑒定出15 個化合物（見圖1），并對部分化合物進行了抗菌和細胞毒活性評價。

圖1 化合物1 ～15 的化學結構Fig 1 Structures of compounds 1 ～15

1 材料

Bruker AV-400/AV-500/AV-600 型核磁共振儀（德國Bruker 公司）；Agilent 1290 UPLC-6545 accurate mass Q-TOF 色譜-質譜聯用儀、Agilent 1200 型分析高效液相色譜儀、Agilent 1100 型半制備型高效液相色譜儀（美國Agilent 科技公司）；YMC-pack ODS-A 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；YMC-pack ODS-A 色譜柱（250 mm×10 mm，10 μm）；C18反相硅膠（40 ～75 μm，日本Kasugai）；硅膠（60 ～100 目，200 ～300 目，青島海洋化工有限公司）；Sephadex LH-20 凝膠（德國Healthcare Uppsala Swedeb）；所用試劑均為分析純。

HepG2 和SMMC-7721 肝癌細胞（中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心）；實驗菌株MRSA（Methicillin-resistantStaphylococcus aureus）及Escherichia coli來自廣東省微生物培養中心。

實驗目標菌株分離自美麗薄子木枝葉，美麗薄子木枝葉于2016年9月采自中國科學院華南植物園，由華南植物園王發國副研究員鑒定。該真菌由北京擎科新業生物技術有限公司經ITS 序列分析鑒定為Rhytidhysteronsp.BZM-9，目前該樣品標本保存于中南大學湘雅藥學院天然藥物化學實驗室。

2 菌株的發酵、萃取及其代謝產物的分離

用接種環挑取適量菌絲接種至裝有200 mL PDB 的三角瓶中，在恒溫培養搖床中培養5 d（28℃，130 r·min－1），制備得到種子液。將種子液接種至無菌大米培養基中，共培養60 瓶，室溫下靜態發酵培養30 d，得到固體發酵物。發酵完成后用乙酸乙酯將大米發酵物萃取3 次，將有機溶劑減壓蒸發獲得粗提物浸膏（50 g）。

乙酸乙酯浸膏經硅膠柱層析，采用PE-EAMeOH（100∶0∶0 ～0∶0∶100）梯度洗脫，得到10 個組分（Fr.A ～Fr.J）。Fr.F 再經硅膠柱層析，以CH2Cl2-MeOH（100∶0 ～0∶100）梯度洗脫，得到8 個組分（Fr.F-1 ～Fr.F-8）。Fr.F-3 經反復硅膠柱層析及Pre-HPLC 得到化合物1（20.3 mg）、2（15.8 mg）、7（3.5 mg）、8（5.8 mg）和9（10.3 mg）。Fr.F-4 經Sephadex LH-20 柱層析，甲醇洗脫，得到4 個組分（Fr.F-4-1 ～Fr.F-4-4）。Fr.F-4-2 依次經硅膠柱層析、Pre-HPLC 得到化合物3（7.3 mg）、4（2 mg）、5（6.6 mg）和6（1.6 mg）。Fr.F-5 經ODS 柱層析，采用MeOHH2O（20∶80 ～100∶0）梯度洗脫，得到8 個組分（Fr.F-1 ～Fr.F-8）。Fr.F-2 經Pre-HPLC 得到化合物14（2.1 mg）。Fr.F-3 依次經硅膠柱層析、Pre-HPLC 得化合物10（5.4 mg）。

Fr.E 經ODS 柱層析，采用MeOH-H2O（20∶80～100∶0）梯度洗脫，得到8 個組分（Fr.E-1 ～Fr.E-8）。Fr.E-5 經反復硅膠柱層析，再通過Pre-HPLC得到化合物11（2.3 mg）和13（3.5 mg）；Fr.E-6 依次經硅膠柱層析、Pre-HPLC 得到化合物12（8.5 mg）；Fr.E-7 經反復硅膠柱層析得到化合物15。

3 結構鑒定

化合物1：白色無定型粉末，易溶于甲醇和二甲基亞砜（DMSO），HR-ESI-MSm/z：259.0608 [M＋H]＋。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.24（1H，d，J＝2.4 Hz，H-6），6.69（1H，d，J＝3.0 Hz，H-5'），6.60（1H，d，J＝3.0 Hz，H-3'），6.35（1H，d，J＝2.4 Hz，H-4），2.75（3H，s，6'-CH3）。13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：140.0（C-1），98.9（C-2），166.2（C-3），102.2（C-4），166.9（C-5），105.8（C-6），167.6（C-7），111.0（C-1'），154.5（C-2'），102.7（C-3'），159.9（C-4'），118.6（C-5'），139.8（C-6'），25.9（6'-CH3）。以上數據與文獻報道[13]基本一致，化合物1 鑒定為alternariol。

化合物2：褐色固體，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：275.0555 [M ＋H]＋。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.23（1H，d，J＝1.8 Hz，H-9），6.68（1H，s，H-2），6.35（1H，d，J＝1.8 Hz，H-7），2.66（3H，s，H-10）。13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：126.9（C-1），116.3（C-2），146.3（C-3），130.9（C-4），141.3（C-4a），164.8（C-5a），97.5（C-6），100.6（C-7），165.0（C-8），104.2（C-9），139.1（C-9a），109.8（C-9b），23.9（C-10），165.4（C-11）。 以上數據與文獻報道[14]基本一致，化合物2 鑒定為porric acid E。

化合物3：黃色固體，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：223.0987 [M ＋H]＋。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：6.39（1H，s，H-4），1.97（3H，s，H-11），1.89（1H，m，H-8a），1.80（1H，m，H-8b），1.48（3H，s，H-10），0.64（3H，t，J＝7.2 Hz，H-9）。13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：169.3（C-1），86.6（C-3），99.5（C-4），163.2（C-5），111.4（C-6），155.2（C-7），153.5（C-3a），103.5（C-7a），32.5（C-8），8.6（C-9），26.2（C-10），8.1（C-11）。以上數據與文獻報道[15]基本一致，化合物3 鑒定為3-ethyl-5，7-dihydroxy-3，6-dimethylphthalide。

化合物4：白色針狀晶體，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：209.0814 [M ＋H]＋。1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6）δ：5.20（2H，s，H-3），3.85（3H，s，H-10），2.09（3H，s，H-9），2.06（3H，s，H-8）。13C-NMR（125 MHz，DMSO-d6）δ：169.2（C-1），68.5（C-3），113.7（C-4），162.4（C-5），118.4（C-6），155.8（C-7），147.3（C-3a），107.4（C-7a），11.8（C-8），9.6（C-9），62.4（C-10）。以上數據與文獻報道[16]基本一致，化合物4 鑒定為5-羥基-7-甲氧基-4，6-二甲基-2-苯并呋喃酮。

化合物5：黃色固體，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：223.0626 [M ＋H]＋。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：10.18（1H，s，H-10），5.35（2H，s，H-3），3.92（3H，s，H-9），2.01（3H，s，H-8）。13H-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：172.5（C-1），70.1（C-3），114.8（C-4），168.5（C-5），121.0（C-6），160.9（C-7），152.5（C-3a），104.9（C-7a），9.2（C-8），61.8（C-9），190.6（C-10）。以上數據與文獻報道[17]基本一致，化合物5 鑒定為6-formyl-7-hydroxy-5-methoxy-4-methylphalide。

化合物6：黃色固體，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：223.0626 [M ＋H]＋。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：6.91（1H，s，H-7），5.22（2H，s，H-3），3.87（3H，s，H-9），2.16（3H，s，H-8）。13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：172.8（C-1），68.3（C-3），150.0（C-4），120.2（C-5），161.1（C-6），96.8（C-7），123.5（C-3a），126.9（C-7a），7.9（C-8），55.0（C-9）。以上數據與文獻報道[18]基本一致，化合物6 鑒定為4-hydroxy-6-methoxy-5-methylphthalide。

化合物7：白色固體，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：271.0582 [M ＋Na]＋。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：6.71（1H，d，J＝2.4 Hz，H-6），6.65（1H，d，J＝2.4 Hz，H-8），5.96（1H，s，H-3），4.03（2H，s，H-1'），3.55（3H，s，-OCH3），2.28（3H，s，H-9）。13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：164.7（C-2），118.9（C-3），178.2（C-4），137.4（C-5），110.8（C-6），161.1（C-7），102.1（C-8），114.2（C-4a），159.5（C-8a），19.9（C-9），40.1（C-1'），171.6（C-2'），51.7（-OCH3）。以上數據與文獻報道[19]基本一致，化合物7 鑒定為2-甲基-5-甲氧羰甲基-7-羥基色原酮。

化合物8：白色固體，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：235.0968 [M ＋H]＋。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：6.66（1H，d，J＝2.4 Hz，H-8），6.62（1H，d，J＝2.4 Hz，H-6），5.97（1H，s，H-3），4.03（1H，m，H-2'），2.65（3H，s，H-9），2.58（2H，m，H-1'），1.15（3H，d，J＝6.4 Hz，H-3'）。13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：165.3（C-2），112.0（C-3），178.8（C-4），141.8（C-5），116.9（C-6），161.4（C-7），101.1（C-8），114.9（C-4a），159.6（C-8a），43.3（C-1'），64.5（C-2'），23.9（C-3'），22.9（5-CH3）。以上數據與文獻報道[20]基本一致，化合物8 鑒定為2-（2'-hydroxypropyl）-5-methyl-7-hydroxychromone。

化合物9：白色固體，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：213.0507 [M ＋H]＋。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：6.64（1H，d，J＝2.4 Hz，H-6），6.63（1H，d，J＝2.4 Hz，H-8），6.00（1H，s，H-3），2.71（3H，s，H-10），2.32（3H，s，H-9）。13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：166.7（C-2），115.6（C-3），182.1（C-4），163.2（C-5），118.1（C-6），143.7（C-7），101.7（C-8），111.4（C-4a），161.5（C-8a），19.9（C-9），23.2（C-10）。以上數據與文獻報道[21]基本一致，化合物9 鑒定為altechromones A。

化合物10：淺黃色固體，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：193.0864 [M ＋H]＋。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：7.44（1H，dd，J＝7.8，1.8 Hz，H-8），7.41（1H，t，J＝7.8 Hz，H-7），7.28（1H，dd，J＝7.8，1.8 Hz，H-6），5.10（1H，t，J＝3.6 Hz，H-4），3.85（3H，s，-OCH3），2.96（1H，m，H-2a），2.41（1H，m，H-2b），2.11（2H，m，H-3）。13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：198.3（C-1），32.7（C-2），30.6（C-3），58.9（C-4），157.3（C-5），116.5（C-6），129.4（C-7），118.0（C-8），133.5（C-9），132.6（C-10），56.4（-OCH3）。以上數據與文獻報道[22]基本一致，化合物10 鑒定為4-O-methylscleron。

化合物11：淺黃色固體，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：237.1121 [M ＋H]＋。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：6.18（1H，s，H-5），5.21（1H，m，H-2'），3.75（3H，s，H-8），1.95（3H，s，H-9），1.77（3H，s，H-4'），1.67（3H，d，J＝6.4 Hz，H-3'）。13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：103.7（C-1），160.7（C-2），109.4（C-3），160.5（C-4），109.3（C-5），146.8（C-6），171.3（C-7），52.4（C-8），8.6（C-9），138.7（C-1'），120.6（C-2'），14.1（C-3'），18.7（C-4'）。以上數據與文獻報道[23]基本一致，化合物11 鑒定為pilobolusate。

化合物12：深褐色固體，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：179.1071 [M ＋H]＋。1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6）δ：9.03（2H，br s，1/3-OH），6.32（2H，s，H-4，H-6），5.72（1H，q，J＝6.5 Hz，H-2'），1.90（3H，s，H-3'），1.86（3H，s，H-4'），1.70（3H，d，J＝6.5 Hz，H-7）。13C-NMR（125 MHz，DMSO-d6）δ：156.3（C-1），109.1（C-2），156.3（C-3），103.8（C-4），141.5（C-5），103.8（C-6），8.9（C-7），135.5（C-1'），120.6（C-2'），14.5（C-3'），15.7（C-4'）。以上數據與文獻報道[24]基本一致，化合物12 鑒定為aspergillusphenols A。

化合物13：淡黃色固體，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：183.0656 [M ＋H]＋。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：6.15（1H，d，J＝2.4 Hz，H-4），6.14（1H，d，J＝2.4 Hz，H-2），3.79（3H，s，-OCH3），2.27（3H，s，H-8）。13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：161.6（C-1），100.9（C-2），167.4（C-3），110.8（C-4），141.2（C-5），106.1（C-6），170.7（C-7），22.5（C-8），52.2（-OCH3）。以上數據與文獻報道[25]基本一致，化合物13 鑒定為苔色酸甲酯。

化合物14：黃色固體，易溶于甲醇和DMSO，HR-ESI-MSm/z：146.0401 [M ＋H]＋。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.14（1H，br s，-NH-），9.93（1H，s，H-10），8.29（1H，s，H-2），8.09（1H，d，J＝7.8 Hz，H-4），7.52（1H，d，J＝7.8 Hz，H-7），7.25（2H，m，H-5/6）。13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：139.0（C-2），118.6（C-3），123.9（C-4），122.6（C-5），120.8（C-6），112.9（C-7），137.5（C-8），124.6（C-9），185.5（C-10）。 以上數據與文獻報道[26]基本一致，化合物14 鑒定為1H-indole-3-carboxaldehyde。

化合物15：黃色固體，易溶于氯仿，HRESI-MSm/z：393.3153 [M ＋H]＋。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：6.61（1H，d，J＝9.5 Hz，H-7），6.02（1H，d，J＝9.5 Hz，H-6），5.74（1H，s，H-4），5.24（2H，m，H-22/23），1.06（3H，d，J＝6.5 Hz，H-21），1.00（3H，s，H-19），0.96（3H，s，H-18），0.93（3H，d，J＝7.0 Hz，H-28），0.84（6H，d，J＝6.5 Hz，H-26/27）。13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：34.1（C-1/C-2），199.5（C-3），123.0（C-4），124.5（C-5），124.4（C-6），134.0（C-7），164.4（C-8），44.3（C-9），36.8（C-10），19.0（C-11），35.6（C-12），44.0（C-13），156.1（C-14），25.4（C-15），27.7（C-16），55.7（C-17），19.0（C-18），16.7（C-19），39.3（C-20），21.1（C-21），135.0（C-22），132.5（C-23），42.9（C-24），33.1（C-25），20.0（C-26），19.7（C-27），17.7（C-28）。以上數據與文獻報道[27]基本一致，化合物15 鑒定為ergosta-4，6，8（14），22-tetraen-3-one。

4 生物活性測定

4.1 抗腫瘤活性測定

以阿霉素（上海愛研化工科技有限公司，批號：AYCB1087）為陽性對照，測試了化合物3～6和11 ～13 對兩種肝癌細胞（HepG2 和SMMC-7721）的增殖抑制活性。首先將HepG2和SMMC-7721 細胞株在含10%新生牛血清的RPMI 1640培養液中，于37℃、5% CO2的培養箱內培養。收集對數生長期的兩種肝癌細胞，以1×104個細胞/孔接種于96 孔板，貼壁培養24 h 后。每孔分別加入2 μL 待測化合物，陰性對照組和空白組分別加入等體積DMSO 和培養液。培養48 h 后，再加入20 μL MTT 溶液，繼續孵育4 h。棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，結晶充分溶解后，用酶標儀在490 nm 波長處測定各孔吸光度值，并計算IC50值。

結果顯示，只有化合物12 對SMMC7721細胞顯示出較強的細胞毒活性（IC50＝0.338 μmol·L－1），其活性相當于陽性對照阿霉素（IC50＝0.3 μmol·L－1），其余化合物在測試的最大濃度下（≥80 μmol·L－1）均未顯示出增殖抑制活性。

4.2 抗菌活性測定

以萬古霉素（上海麥克林生化科技有限公司，批號：V871983）為陽性對照，參考美國臨床實驗室標準委員會（CLSI20150）標準，采用96 孔板二倍稀釋法測試化合物3 ～6 和11 ～14對MRSA 及Escherichia coli的最低抑菌濃度（MIC）值。結果顯示，僅化合物12 對MRSA 顯示出較好的抑制活性（MIC＝6.25 μg·mL－1），其余化合物在測試的最大質量濃度下（≥ 50 μg·mL－1）對MRSA 及Escherichia coli均未顯示出抑制活性。

5 結果與討論

植物內生真菌具有普遍性和多樣性，自然界幾乎所有的植物組織中均含有內生真菌，其參與植物生長過程中的重要環節，不僅能代謝產生與宿主植物相同或相似的代謝產物，自身還能生成許多活性代謝物，是活性先導化合物的重要來源。

本研究從美麗薄子木植物內生真菌Rhytidhysteronsp.BZM-9 乙酸乙酯提取物中共分離鑒定出15 個化合物，包括6 個酚酸類、4 個苯酞類、3 個色原酮、1 個吲哚生物堿及1 個甾體，以上所有化合物均為首次從該屬真菌中分離得到。活性測試結果顯示化合物12 可能為抗菌或抗腫瘤藥物開發提供先導化合物。以上研究結果不僅豐富了Rhytidhysteron屬真菌化學成分多樣性，也為進一步開發美麗薄子木內生真菌的次生代謝產物提供一定的研究基礎。