組學技術在中醫藥防治重癥肌無力中的應用進展*

馮雨菡，張運克，2

1.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046； 2.河南中醫藥大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450000

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是一種獲得性自身免疫性疾病，由乙酰膽堿受體抗體(anti-acetylcholine receptor antibody，AChR-Ab)介導、細胞免疫依賴和補體參與，從而導致神經、肌肉接頭的傳遞功能出現障礙，具體表現為骨骼肌收縮無力[1-2]。乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor，AchR)抗體一直是MG最常見的致病性抗體，但隨著近些年對MG研究的深入，發現肌肉特異性受體酪氨酸激酶(muscle specific receptor tyrosine kinase，MuSK)抗體、低密度脂蛋白受體相關蛋白4(low density lipoprotein receptor-related protein 4，LRP4)抗體以及蘭尼堿受體(ryanodine receptor，RyR)抗體對MG的發病同樣發揮著作用，這些抗體能干擾乙酰膽堿受體的聚集、影響神經肌肉接頭的信號傳遞和功能，從而導致MG的發病。MG患者全身骨骼肌均可受累，活動后癥狀加重，休息后較前減輕，臨床以眼外肌受累最為常見，多表現為上瞼下垂、復視，其他肌群受累表現為咀嚼無力、飲水嗆咳、苦笑面容、鼓腮漏氣、抬頭困難等癥狀，發病早期癥狀多為一組肌群出現無力，逐漸累及全身[3]。研究發現，MG的患病率為每10萬居民400～1 800例，發病率為每10萬居民40～120例[4]，且隨血清學的普及呈遞增趨勢。目前，MG的治療主要以膽堿酯酶抑制劑、免疫抑制劑、靜脈注射免疫球蛋白、血漿置換和胸腺切除為主，膽堿酯酶抑制劑和腎上腺皮質激素是目前應用最為廣泛的一線藥物。目前，西藥治療MG可有效改善患者臨床癥狀，但面臨的問題也極為突出，相關藥物缺乏統一標準，多依靠臨床經驗給藥，且一些藥物存在較為嚴重的不良反應，如糖皮質激素的應用會產生肥胖、高血壓、高血糖、骨質疏松等不良反應，且易產生激素依賴。因此，深入探索MG的發病機制，尋找更為安全有效的治療方法刻不容緩。

中醫學無“重癥肌無力”的說法，根據其臨床癥狀，可將其歸屬于“痿證”的范疇。中醫對“痿證”的認識最早源于《黃帝內經》[5]，《素問》提出了“治痿獨取陽明”的治療原則。MG的肌無力癥狀在全身多處骨骼肌均可發生，其乏力的臨床表現與氣虛密切相關。中醫認為，脾主運化，主肌肉，認為該病與脾具有較為緊密的聯系?！饵S帝內經》所載：“脾主身之肌肉，腎主身之骨骼……脾氣熱，則胃干而渴，肌肉不仁，發為肉痿；腎氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發為骨痿。”認為MG的發病與脾胃及腎有關。目前，多數醫家認為本病病位主要在脾腎，根本病機為先天不足或后天失調，導致脾腎虧虛、精失所養、氣血不足、肢體肌肉失養等以虛損為主的癥狀[6-9]。MG的證型較為分散多樣，不同專家根據其臨床經驗得出的辨證分型亦不同。呂志國等[10]通過專家共識法，將該病證型最終確定為脾腎兩虛證、脾胃氣虛證、氣陰兩虛證、大氣下陷證4個證型，認為本病的根本病機為脾腎虧虛，以健脾益氣、補脾益腎為基本治則。雙曉萍等[11]通過分析近30年發表的相關文獻，發現多數醫家臨床治療MG應用最多的方劑依次為補益劑、祛濕劑、補陽劑，應用頻率最高的中藥為黃芪。最近的一項Meta分析系統評價了補中益氣湯聯合西藥治療MG的療效和安全性，認為中藥方劑聯合西藥較單純西藥治療效果更好，且不良反應小，安全性高[12]。楊士杰[13]研究發現，補中益氣湯加減聯合免疫抑制劑的有效率明顯高于基礎西藥組，比較兩組治療18個月后的數據，發現前者的CD4+CD25+Treg細胞比顯著升高，AchRAb水平顯著降低，提示補中益氣湯加減聯合免疫抑制劑治療MG療效更好，不良反應更小。有學者經系統評價發現，相比于單純西藥治療MG，中西醫結合治療在改善患者臨床癥狀方面更具優勢，且能夠有效降低復發率，提高有效率[14-15]。綜上，中西醫結合治療MG較單純西藥更具優勢，亟須進行更為深入的探索。目前，中醫藥已被廣泛應用于MG的治療，具有價廉、方便、療效好、不良反應少等優勢[16]。

組學技術基于系統生物學產生，其發展亦會對系統生物學產生影響。組學技術多樣，基因組學、轉錄組學、代謝組學、蛋白質組學、免疫組學、脂類組學、糖組學等[17]均屬于組學技術的范疇，其中基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學發展較早，運用廣泛，被稱為“四大組學技術”，對于人體生理病理機制的研究而言意義重大。組學技術可有效改善中醫藥作用靶標和機制不明的問題，而多組學技術聯合可更好地闡明疾病作用機制，使中醫藥迅速準確地找出治療疾病的生物標志物，科學評估臨床價值[18]。此外，組學技術具有高通量特點，可為MG發病潛在的分子機制和信號通路提供新的研究方向，為發現新的治療靶點提供依據，加速對MG治療的研究步伐。目前，已有研究發現了一些具有參考價值的MG生物標志物及靶標。

1 四大組學技術

1.1 蛋白質組學蛋白質組學出現較早，主要從蛋白質的表達水平、翻譯后修飾、亞細胞定位或遷移、蛋白與蛋白相互作用等方面進行研究[19]。該技術在MG中應用廣泛，研究方法多樣，包括雙向凝膠電泳、熒光差異凝膠電泳、同位素親和標記、同位素標記相對和絕對定量技術、非標記定量技術等方法。蛋白質組學能從蛋白質水平深入認識疾病，篩選出與相關的蛋白質標志物和潛在的治療靶點，為進一步認識疾病的作用機制并找出新的有效的治療方法提供思路。

蛋白質組學在中醫藥領域中的應用相當廣泛，它能進一步補充中醫證候的診斷標準；找出中藥或復方制劑的作用靶點和機制，并對方藥中各中藥“君臣佐使”的配伍原則作出闡釋等[20-25]。蛋白質組學在蛋白質的表達、結構和功能等方面有其獨特的研究方法，主要研究整體的蛋白質活動并找出其規律，這與中醫整體觀念和辨證論治思想高度一致。蛋白質組學具有的整體性、動態性、穩定性等特點，與中醫學證候的整體觀、恒動觀相通，說明蛋白質組學在中醫證候本質的研究中具有較大優勢[26]。同時，疾病的發生發展過程、同病異治和異病同治的辨證施治以及中藥(復方)對機體調節的方式也是多環節、多靶點、多成分、多通路的整體協同過程[27]。

1.2 基因組學基因組學技術能夠研究基因組的表達、多樣性和功能，它在生物體內所有基因水平上分析核苷酸序列及基因功能。在基因組這一水平上的研究，不僅包括堿基序列的組成及變化，還包括DNA甲基化、染色質修飾等非序列變化引起的基因表達水平的變化[28]?，F在常用的基因組學技術有定量分析技術(實時熒光PCR)、高通量技術(基因芯片、測序)等；測序技術包括宏基因組測序、全基因組重測序、全基因組Bisulfite測序、外顯子組測序、目標區域測序、Me-DIP測序、RRBS測序等[29]。

基因組學在中醫藥領域中的應用多樣，它能說明基因的多態性和中藥之間的聯系；對中醫的經絡、穴位等方面作出補充，并解釋其作用機制；建立中醫“證候”表達譜等[30-33]?；蚪M學同樣具有整體性和穩定性的特點，這與中醫證候方面的特性不謀而合，它能進一步明確中醫證候的物質基礎，準確、客觀地闡明疾病的發生發展規律，讓我們對疾病的認識更加深入。

1.3 轉錄組學轉錄組學可應用于研究細胞在某一功能下所含mRNA的類型與拷貝數，發現不同功能狀態下mRNA表達的不同，從而找出與功能狀態變化聯系緊密的重要基因群[34]。轉錄組學主要有基因表達序列分析、基因芯片、表達序列標簽、cDNA-AFLP等[35]。

轉錄組學在中醫藥領域中的應用獨具特色，能夠鑒別中藥材真假和中藥次生代謝產物生物合成功能基因，找出中藥及復方的作用靶點與機制，對中醫的證候診斷標準進一步完善[36-37]。轉錄組學能研究特定條件下細胞內基因的轉錄和調控[38]，這一思想與中醫的整體觀念高度一致。從轉錄水平研究中醫證候相關基因的轉錄調控，有助于建立中醫證候的生物學基礎，為中醫證候的規范化和現代化提供依據。

1.4 代謝組學代謝組學較基因組學、轉錄組學、蛋白質組學等組學技術而言，出現較晚，主要通過信息建模、系統整合等手段研究生物體代謝物中的動態變化，從而發現其規律[39]。代謝組學主要技術有核磁共振技術、液相色譜質譜聯用、氣相色譜質譜聯用、毛細管電泳質譜聯用、同位素標記質譜等。近年來，代謝組學發展迅速，在疾病診斷、藥物研發及相關毒理研究等領域均有廣泛的應用前景[40]。

代謝組學在中醫藥領域中的應用較為廣泛，能對中藥材質量進行評價、發現中藥復方中各個藥物配伍的機制和規律、探索中藥治療疾病的作用機制、找出相關疾病的代謝生物標志物、建立中醫證候代謝組等[41-44]，從而有效推動中醫藥領域的發展。代謝組學研究將整體與微觀研究相結合，由于其較強的綜合信息優勢，與中醫整體觀、系統觀相符[45-47]，已被廣泛應用于中醫藥相關研究。華何與等[48]梳理了近年來中醫藥領域中應用代謝組學的文獻，認為在以中醫藥治療疾病的過程中，生物體內會發生代謝物量和性的變化，而代謝組學可將其表現出來，若將代謝組學與中醫證型相結合，可進一步推動中醫藥現代化研究。

2 組學在MG中的應用進展

2.1 蛋白質組學蛋白質組學已在許多研究中被應用于MG發病機制和診斷治療的研究。Zhang等[49]運用同位素標記相對和絕對定量技術(isobaric tags for relative and absolute quantitation techniques，iTRAQ)技術對補中益氣湯治療MG患者的血漿差異蛋白質進行篩選，鑒定出618個蛋白質，發現加味補腎湯可能通過調節某些重要蛋白的表達而發揮治療MG的作用，確定了其潛在的生物標志物，對MG的發病機制加深了認識。宋文集等[50]以雙向凝膠電泳技術對脾胃虛損型MG患者與正常人的骨骼肌蛋白進行分離，在實驗組脾胃虛損型MG患者與對照組患者骨骼肌中共找到27個差異蛋白，對其中選擇比值較大的15個蛋白質點進行鑒定，共鑒定出10個蛋白，發現影響MG的發病機制有很多，與肌細胞結構蛋白表達變化、線粒體能量代謝障礙、鈣通道以及氧自由基等均有關聯。

2.2 基因組學Xi等[51]利用腫瘤基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)數據庫中11個胸腺瘤相關MG和10個非MG胸腺瘤的RNA測序數據計算其差異表達基因，最終用實時熒光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR)檢測到sBTLA、CCR7、TNFRSF25和ANKRD55的過度表達，可以部分解釋胸腺瘤相關MG的發病機制。Nel等[52]利用全基因組測序確定了眼肌型MG的候選易感基因HLA-DPA1和HLA-DPB1。張薈雪等[53]研究發現，MG的發病與其易患基因及多態性有關，可在基因及遺傳水平上對MG的發病機制進行研究，以找出更為有效的治療方法，為MG的藥物治療提供新靶點。中醫辨證論治的重點為“同病異治”與“異病同治”，運用何種治療方式并非取決于疾病，而是取決于“證候”。Wu等[54]從基因水平觀察到陽虛證、陰虛證患者在PPARD、PPARG和APMI 3個基因的單個單核苷酸多態性和單倍體上有顯著差異。黨照麗[55]發現腎虛質與免疫關系密切，應用基因芯片技術分析比較了腎虛質大鼠、正常質大鼠及應用補腎藥物后腎虛質大鼠脾臟淋巴細胞免疫相關差異表達基因譜，篩選出免疫相關差異表達的基因進行研究，發現補腎中藥能有效改善腎虛質，可能是通過調控某些基因的表達而發揮作用。

2.3 轉錄組學Park等[56]報道了一項使用RNA測序的初步血液轉錄組研究，發現28個差異表達基因可能與MG疾病活動有關，表明參與細胞運輸和凋亡的基因的轉錄豐度譜可能是MG患者疾病活動的分子標志。Jiang等[57]利用Solexa測序技術，在陰虛熱證患者和健康對照者之間進行轉錄組學研究，鑒別了反映陰虛熱證特征的差異表達mRNAs，揭示其潛在的生物學機制，為同證型MG的探索提供了思路。黃攀等[58]研究發現，MG患者的血清中存在高表達的miR-126和低表達的Foxp3 mRNA，其中高表達的miR-126可在一定程度上抑制Foxp3的表達，導致MG的發病。

2.4 代謝組學Lu等[59]使用基于LC-MS的血清代謝組學方法結合多變量統計分析，對不同類型的MG患者進行鑒別和分類，應用液相色譜-傅立葉變換質譜對42例MG患者和16例健康志愿者的血清樣本進行分析，觀察到早期和晚期MG患者之間代謝譜變化不同，并鑒定出9種生物標志物，包括γ-氨基丁酸和1-磷酸鞘氨醇。Blackmore等[60]為了識別MG特有的生物標志物，運用雙對照、多標記代謝組學分析方法，最終在血清呈陽性的MG患者中發現，表明代謝組學技術能夠將MG患者和非MG患者進行區分。陳銀芳等[61]研究發現，大鼠體內有5種代謝產物在服用補氣藥前后存在差異，這些代謝差異物均與能量代謝有關，為補氣藥干預氣虛證的作用機制研究提供了生物學基礎。黃張杰等[62]為了探索補中益氣湯對脾氣虛證大鼠尿液代謝表型變化的影響，運用代謝組學技術，發現補中益氣湯對脾虛證大鼠的氨基酸代謝、脂質代謝和能量代謝水平均有調節作用。上述研究表明，代謝組學在MG的檢測和分級、發現疾病生物標志物、發現中藥作用物質基礎方面具有較大潛力。

3 思考與展望

組學概念的提出以及組學技術的應用，為中醫藥研究提供了新的方法，找到了新的方向。組學是一個由整體理念產生的概念，它與中醫藥的內涵相吻合，其性質也與中醫藥的整體思路一致。生物標志物在現代醫學治療MG的過程中起到輔助診斷、評價療效和預后的作用。研究表明，蛋白質組學能夠通過中藥方劑檢測出MG生物標志物及潛在的治療靶點；轉錄組學能夠通過揭示潛在生物學機制為陰虛證MG的探索提供思路；基因組學發現，某些中藥能通過調控基因表達發揮對腎虛質大鼠的治療作用，從而探索出同證型MG的治療方法；代謝組學在發現中藥作用物質基礎方面具有較大潛力。然而，總結以上研究仍能發現其存在一些不足之處：①組學技術對中醫藥的研究大部分停留在證候層面，臨床研究過少。②組學技術對于MG的研究大部分停留在西醫方面，中醫藥治療MG的研究較少。因此，今后應加深對MG發病機制的認識，探索中醫藥辨證治療MG的機制闡釋、證候診斷，通過組學技術進一步發現中醫藥對MG生物標志物及潛在治療靶點的作用，探索中醫藥對MG患者中醫證候的作用，以中藥干預臨床試驗并進行療效評價，為中醫辨證治療MG提供更多依據。