一測多評法測定安神寧中4個木脂素含量

宋沛穎，李慧勇，那微，筆雪艷，肖宇

(1.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036；2.黑龍江省藥品檢驗研究院，黑龍江 哈爾濱 150088；3.國家藥品監(jiān)督管理局中藥質(zhì)量研究與評價重點(diǎn)實驗室，黑龍江 哈爾濱 150088；4.黑龍江省中藥質(zhì)量研究與評價重點(diǎn)實驗室，黑龍江 哈爾濱 150088)

安神寧為中藥糖漿劑，由刺五加浸膏、靈芝、五味子制備而成，其中靈芝、五味子粉碎成粗粉后加60%乙醇浸漬壓榨，壓榨液加刺五加浸膏攪勻制備而成，具扶正固本、益氣健脾、補(bǔ)腎安神作用，主要用于神經(jīng)衰弱、食欲不振、全身無力等。處方中五味子為木蘭科植物五味子[Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.]的干燥成熟果實，具收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心作用[1]。其中木脂素類成分在五味子果實中含量較高，也是發(fā)揮五味子多種功效的有效成分，主要含有五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲、五味子醇甲、五味子醇乙等[2-5]。

在中藥、天然藥物等復(fù)雜體系的成分分析和質(zhì)量評價工作中，應(yīng)用傳統(tǒng)外標(biāo)法對產(chǎn)品含量進(jìn)行測定，對照物質(zhì)使用量大且品類繁多，部分對照物質(zhì)穩(wěn)定性較差，對照品制備成本高，技術(shù)操作難度大，質(zhì)量監(jiān)控過程煩瑣，對產(chǎn)品進(jìn)行多指標(biāo)整體控制，逐漸成為產(chǎn)品質(zhì)量控制的研究方向[6-7]。本研究應(yīng)用外標(biāo)法同時測定安神寧中4個木脂素含量，同時建立以五味子醇甲為內(nèi)參物，確定五味子醇甲與五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素之間的相對校正因子，計算各成分的含量的一測多評方法，可用于安神寧的質(zhì)量控制[8-12]。

1 儀器與材料

Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；Waters e2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；Thermo Evolution 201紫外-可見分光光度計(Thermo公司)；超聲波清洗儀AS10200A(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；AE240電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Laborota 4001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heidolph公司)。

Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，Thermo AcclaimTM120 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm 120A)色譜柱；五味子醇甲對照品(批號：110857-201714，含量99.9%)、五味子甲素對照品(批號：110764-201714，含量99.3%)、五味子乙素對照品(批號：110765-200710，純度>98%)均購于中國食品藥品檢定研究院；五味子醇乙對照品(批號：32120010，純度>98%)來自上海安譜實驗科技股份有限公司；研究用10批安神寧樣品由黑龍江雙蘭星制藥有限公司(國藥準(zhǔn)字Z23020211)提供；乙腈、甲醇為色譜純(Honeywell公司)，其余試劑為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 檢測波長確定 取4種對照品適量，制成每1 mL各含0.05 mg的混合對照品溶液，以Thermo Evolution 201紫外-可見分光光度計、島津LC-2010A高效液相色譜儀(DAD檢測器)在190～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長掃描，4種木脂素混合溶液在217 nm處有最大吸收。

2.1.2 流動相組成及洗脫程序[13-15]乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫程序：0～10 min，20% A→60% A；10～25 min，60% A；25～35 min，60% A→75% A；35～45 min，75% A→80% A；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含五味子醇甲30 μg、五味子醇乙10 μg、五味子甲素10 μg、五味子乙素10 μg的混合溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密量取供試品溶液10 mL，至25 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理5 min，放冷至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 測定方法

2.3.1 專屬性試驗 按處方比例、工藝制備缺五味子藥材的陰性樣品，按“2.2.2”項供試品溶液制備陰性對照溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)入液相色譜儀進(jìn)行分析，結(jié)果陰性對照色譜圖中，在五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素對照品溶液和供試品溶液色譜圖相應(yīng)的保留時間處無色譜峰出現(xiàn)，五味子醇甲色譜峰相鄰處雖有一小色譜峰可能對樣品產(chǎn)生干擾，但其面積小于樣品中五味子醇甲峰面積的5%，符合《中國藥典》2020年版要求[1](見圖1)。

A.對照品；B.供試品；C.陰性樣品

2.3.2 線性關(guān)系考察 取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素對照品適量，精密稱定，配制系列濃度對照品混合溶液，進(jìn)入液相色譜儀進(jìn)行分析，記錄峰面積，以對照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，計算五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果4種成分線性關(guān)系良好，結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察(n=8)

2.3.3 精密度試驗 取混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素RSD分別為0.1%、0.1%、0.3%、0.2%，精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗 取安神寧樣品(批號：150901)，按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)入液相色譜儀進(jìn)行分析，計算五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的平均含量及RSD分別為：五味子醇甲0.083 2 mg·mL-1(RSD=0.5%)、五味子醇乙0.020 0 mg·mL-1(RSD=1.7%)、五味子甲素0.010 4 mg·mL-1(RSD=1.3%)、五味子乙素0.013 0 mg·mL-1(RSD=1.5%)，重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別在0、1、3、6、10、15、21、28 h按“2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積，結(jié)果五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素峰面積RSD分別為 0.3%、0.2%、1.0%、0.3%，穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率 精密稱取已知含量安神寧樣品5 mL(批號：150901，含量見重復(fù)性試驗結(jié)果)，精密加入已知濃度的對照品混合溶液，按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)入液相色譜儀進(jìn)行分析，結(jié)果加樣回收率分別為五味子醇甲98.52%(RSD=0.8%)、五味子醇乙103.43%(RSD=1.4%)、五味子甲素109.69%(RSD=0.9%)、五味子乙素107.92%(RSD=1.7%)，準(zhǔn)確性良好(見表2)。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

2.3.7 耐用性試驗 使用Agilent 1100液相色譜儀，分別選用Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Thermo AcclaimTM120 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm 120A)色譜柱進(jìn)行分析；使用Waters e2695液相色譜儀，Thermo AcclaimTM120 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm 120A)色譜柱在進(jìn)行分析，測定結(jié)果五味子醇甲平均含量0.086 7 mg·mL-1(RSD=0.9%)、五味子醇乙0.021 4 mg·mL-1(RSD=1.5%)、五味子甲素0.016 7 mg·mL-1(RSD=1.9%)、五味子乙素0.019 7 mg·mL-1(RSD=1.7%)，耐用性良好。

2.4 相對校正因子的計算

2.4.2 相對校正因子耐用性考察 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液5 μL，平行進(jìn)樣2次，以五味子醇甲為內(nèi)參物，考察不同液相色譜儀、不同色譜柱五味子醇甲對其他3個成分的相對校正因子(RCF)值，結(jié)果耐用性良好(見表3)。

表3 相對校正因子耐用性考察

2.4.3 相對保留時間RT考察 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液5 μL，平行進(jìn)樣2次，以五味子醇甲為內(nèi)參物，考察不同液相色譜儀、不同液相色譜柱五味子醇甲對其他3個成分的相對保留時間，結(jié)果3個木脂素成分相對保留時間平均值分別為RT五味子醇乙=1.118(RSD=1.0%)、RT五味子甲素=2.349(RSD=1.9%)、RT五味子乙素=2.603(RSD=2.2%)，其相對保留時間應(yīng)在規(guī)定值的±5%范圍之內(nèi)。

2.4.4 一測多評法與外標(biāo)法含量測定結(jié)果比較 取安神寧樣品共10批，按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)入液相色譜儀進(jìn)行分析，應(yīng)用外標(biāo)法(EMS)及本研究建立的一測多評方法(QAMS)對同一供試品溶液同時測定，結(jié)果兩者測定含量結(jié)果基本一致，一測多評方法可用于該品種的含量測定(見表4)。

表4 樣品含量測定結(jié)果(mg·mL-1)

3 討論

3.1 檢測波長的確定 本試驗確定檢驗波長試驗，取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素和五味子乙素對照品制成每1 mL各含0.05 mg的混合對照品溶液，使用Thermo Evolution 201紫外-可見分光光度計，在190～400 nm范圍內(nèi)掃描，混合對照物質(zhì)溶液于217 nm處有最大吸收；用島津LC-2010A高效液相色譜儀DAD檢測器測定最大吸收，五味子醇甲、五味子醇乙在λ=216 nm、五味子甲素在λ=214 nm處、五味子乙素在λ=215 nm處有最大吸收，綜合上述，本試驗選擇217 nm作為測定波長。

3.2 流動相確定 本試驗應(yīng)用甲醇-水、乙腈-水[16-17]兩套系統(tǒng)對樣品進(jìn)行分析測定，結(jié)果甲醇-水系統(tǒng)雖然能達(dá)到較好的分離效果，但是基線漂移幅度大，分離色譜峰的峰面積波動大，而乙腈-水系統(tǒng)基線平穩(wěn)，樣品分離度好。

3.3 溶液穩(wěn)定性 穩(wěn)定性試驗過程中發(fā)現(xiàn)，4個木質(zhì)素類成分24 h內(nèi)穩(wěn)定性好良好，色譜峰面積穩(wěn)定；繼續(xù)監(jiān)測穩(wěn)定性，除五味子醇甲峰面積基本保持穩(wěn)定外，其余3種木質(zhì)素峰面積均發(fā)生改變。同時，五味子醇甲在五味子中含量較大，有指征性。綜上，故本方法選擇五味子醇甲為一測多評內(nèi)參物。