瘦素及其受體在乳腺癌中的作用及機制

張建軍 匡文洋 郭小靖 龍曉彬

(吉安市中心人民醫院腫瘤科，江西 吉安 343000)

乳腺癌屬于臨床常見惡性腫瘤，主要發生在女性群體中，近年呈現發病率升高趨勢。已有報道指出，肥胖是導致乳腺癌發病的危險因素之一，特別是在絕經后女性中，其與乳腺癌預后存在密切聯系〔1〕。瘦素是由肥胖基因編碼表達的小分子蛋白，又被稱為肥胖抑素，屬于重要的脂肪細胞因子〔2〕。在正常乳腺組織中，瘦素及其受體呈低表達狀態，但在乳腺癌中呈高表達狀態，因此，越來越多的學者認為瘦素及其受體與乳腺癌發生、發展存在密切聯系〔3〕。本研究通過對新輔助化療乳腺癌患者瘦素及其受體表達情況進行分析，探究瘦素及其受體與乳腺癌療效、預后之間的關系及作用機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取吉安市中心人民醫院2017年1月至2020年1月收治的乳腺癌患者328例，在經根治性手術治療后均接受新輔助化療干預后分為無變化組(224例)、完全緩解組(64例)、進展組(40例)，患者年齡61～76歲，平均(69.7±5.4)歲；其中男7例，女321例；HR陽性患者124例，HER2陽性患者137例，三陰性患者67例；臨床分期：Ⅰ期54例，Ⅱ期132例，Ⅲ期142例；腫瘤分期：T1期210例，T2期94例，T3期22例，T4期2例。在手術標本中評估新輔助化療后病理反應，乳腺癌原發灶及腋窩淋巴結均無浸潤性癌定義為完全緩解。納入標準：①入組均為乳腺癌患者，且均經穿刺活檢證實；②患者均接受根治性手術治療；③患者無其他部位的惡性腫瘤；④對于本研究知情并同意。排除標準：①患者疾病控制不理想，存在生命危險；②患者臨床資料缺失；③患者存在精神障礙或溝通障礙。本次研究已獲得醫院倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1病理切片制備 對所有入組患者術前粗針穿刺組織樣本進行收集，制成厚度約4 μm的組織切片，貼于載玻片上進行過夜，溫度為67℃。

1.2.2免疫組化染色腫瘤切片 對載玻片進行脫蠟、脫水處理，然后使用磷酸鹽緩沖液(PBS)進行3次沖洗，每次5 min，使用檸檬酸鈉緩沖液進行抗原修復，反應結束后棄檸檬酸鈉緩沖液，使用PBS進行3次沖洗，每次5 min。依次加入一抗、二抗，反應結束后進行二氨基聯苯胺(DAB)顯色，取經辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素加入樣本中進行30 min孵育，使用PBS進行沖洗3次，每次3 min，滴加兒氨基苯胺溶液，顯微鏡下對顯色情況進行觀察。復染選擇蘇木素，浸泡10 s后進行PBS沖洗。經脫水處理后進行封片。

1.2.3觀察瘦素及其受體表達情況 瘦素及其受體染色后呈現棕黃色或黃色，本研究為保證統計結果準確性，由兩名醫師進行判定，每個樣本取5個視野，觀察其染色位置，染色位置位于細胞膜的為瘦素受體，染色位置位于細胞膜及細胞質的為瘦素。采用半定量法進行分析，根據著色比例進行評分，占比10%及以上均為陽性，低于10%為陰性，陰性為0分，10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，75%以上為4分。根據染色情況進行記分，無染色為0分，淺黃色為1分，深黃色為2分，棕褐色為3分。最終得分為陽性細胞占比與染色強度的乘積，并根據所得分數進行等級劃分，9分及以上為強陽性，以“”表示；6～8分為陽性，以“”表示；3～5分為弱陽性，以“+”表示；2分及以下為陰性，以“-”表示。

1.2.4細胞培養 選擇MCF-7細胞及MDA-MB-231細胞進行細胞復蘇，將所選細胞加入含胎牛血清的培養基中，培養環境為5%濃度的二氧化碳，37℃，培養一段時間后進行細胞傳代，當細胞密度在90%及以上時進行細胞傳代，棄培養液，洗滌貼壁細胞，加入胰酶進行消化，確定細胞分離后加入胎牛血清培養液，培養環境為5%濃度的二氧化碳，溫度為37℃。

1.2.5細胞病毒感染 取胎牛血清培養液對提前制備好的細胞進行重懸，觀察密度在80%以上時進行傳代培養，慢性病毒感染時需選擇生長狀態良好細胞。選擇對數細胞進行胰酶消化處理，將制成的懸液進行繼續培養，在進行病毒感染時需確定細胞數目，更換感染培養基，在感染8～12 h后更換常規培養基。觀察感染情況，獲取感染率70%以上狀態良好的細胞進行后續試驗。

1.2.6熒光定量聚合酶鏈反應(PCR) 取培養好的細胞進行RNA提取，高速離心處理，分離上層清液后加入乙醇，再次高速離心處理，分離后加入乙醇再次進行離心處理，棄廢液后加入試劑進行再次離心，經多次離心處理后分離獲得RNA。將制備好的RNA進行反轉錄處理，獲得cDNA，定量測定目的基因。制備敲減核轉錄因子抑制蛋白激酶(IKK)β細胞，將敲減IKKβ細胞作為研究組，與敲減細胞(對照組)進行對照分析。

1.3統計學方法 采用SPSS18.0軟件進行t檢驗、秩和檢驗、Pearson相關性分析。

2 結 果

2.13組瘦素及其受體表達情況 與完全緩解組相比，進展組瘦素“”表達占比明顯降低(P<0.05)，瘦素受體“”表達占比明顯降低(P<0.05)，見表1。不同表達程度免疫組化染色，見圖1。

表1 3組瘦素及其受體表達情況對比〔(n)%〕

圖1 完全緩解組與進展組瘦素受體表達情況(免疫組化染色，×400)

2.2不同分子分型患者瘦素及其受體表達情況 HR陽性患者完全緩解組瘦素受體“”表達占比明顯高于進展組(P<0.05)；HER2陽性患者完全緩解組瘦素“”表達占比明顯高于進展組(P<0.05)，HER2陽性患者完全緩解組瘦素受體“”表達占比明顯高于進展組(P<0.05)，瘦素受體“-、+、”表達占比明顯低于進展組(P<0.05)。三陰性患者完全緩解組瘦素受體“+”表達占比明顯低于進展組(P<0.05)，見表2。與HR陽性患者相比，三陰性患者、HER2陽性患者瘦素及其受體表達“”表達占比明顯升高(P<0.05)，見表3。

表2 不同分子分型患者完全緩解組、進展組瘦素及其受體表達情況對比〔(n)%〕

表3 不同分子分型患者瘦素及其受體表達情況對比〔(n)%〕

2.3各成分在MCF-7及MDA-MB-231細胞中表達情況對比 研究組瘦素及其受體在MCF-7細胞中的表達明顯低于對照組(P<0.05)，在MDA-MB-231細胞中的表達無差異(P>0.05)；研究組核轉錄因子(NF)-κB通路相關基因IKBKG、P65在MCF-7細胞中的表達明顯低于對照組，在MDA-MB-231細胞中的表達明顯高于對照組(P<0.05)；研究組缺氧誘導因子(HIF)在MCF-7細胞中的表達明顯低于對照組(P<0.05)，在MDA-MB-231細胞中的表達無差異(P>0.05)，見表4。

表4 各成分在MCF-7及MDA-MB-231細胞中表達情況對比

3 討 論

瘦素屬于脂肪因子，在與其受體結合時需要通過多種信號通路完成，在糖尿病、腫瘤、心血管疾病及肥胖等多種疾病發生、發展中均有參與〔4〕。瘦素與其受體呈正相關性表達，正常情況下可調節機體能量代謝、生長繁殖等，但是在病理情況下可影響多部位腫瘤生長〔5〕。已有研究指出，肥胖與結直腸癌、乳腺癌、胰腺癌、食道癌等多種腫瘤發生存在密切聯系，并且將肥胖作為絕經后女性乳腺癌發病的危險因素〔6〕。在正常乳腺中瘦素及其受體呈低表達狀態，但乳腺癌組織中瘦素及其受體表達明顯升高，由此可以看出，在乳腺癌發生及預后中瘦素及其受體起到非常關鍵的作用〔7〕。

已有大量研究指出，肥胖會降低乳腺癌預后。有報道指出，接受新輔助化療治療的乳腺癌患者肥胖者完全緩解率低于非肥胖患者〔8〕。也有研究指出，肥胖會降低乳腺癌患者化療病理完全應答率，影響預后〔9〕。雖然關于瘦素在腫瘤患者中呈高表達狀態的研究相對較多，但是對于其與腫瘤患者預后之間關系的結論并不統一〔10〕。本研究推測，瘦素及其受體可影響患者新輔助化療療效，提高腫瘤組織化療敏感性。有研究中指出，HER2高表達的乳腺癌SK-BR-3細胞系中，瘦素可通過相關途徑反式激活HER2〔11〕。因此，認為瘦素及其受體與HER2存在相互促進作用，從而提高化療敏感性。

近幾年，關于NF-κB與腫瘤微血管形成之間關系的研究一直都是醫學熱點。有學者指出，NF-κB活性在食管鱗狀細胞癌中明顯升高，促進血管表皮生長因子表達〔12〕。也有報道指出，腫瘤微血管密度與NF-κB表達存在密切聯系，胃癌組織中存在腫瘤微血管密度及NF-κB表達升高情況，認為NF-κB可促進腫瘤新生血管的形成〔13〕。HIF-1屬于當今臨床化療的常用靶點，已證實HIF水平與腫瘤進展、轉移有著密切聯系，而且HIF屬于瘦素及血管上皮生長因子的上游調節因子，對于瘦素水平可以起到調節作用〔14〕。有報道指出，HIF上游基因為NF-κBp65，可維持HIF活性〔15〕。分析產生本研究結果的原因，認為其可能與瘦素及其受體表達水平有關，但是本次研究并不能直接證實其中的關系，還需進一步研究對相互之間作用機制進行分析。

綜上，在乳腺癌預后評估過程中，瘦素及其受體有著非常高的應用價值，猜測乳腺癌患者瘦素及其受體表達可能與NF-κB通路中IKKβ有關。