紫花地丁抑制HAGLR對前列腺癌細胞凋亡、侵襲及遷移的影響

鄭傳癡 何國平 陳宗平

(遵義醫科大學第二附屬醫院 1藥劑科，貴州 遵義 563100；2腫瘤科；3遵義醫科大學附屬醫院泌尿外科)

前列腺癌是男性致死性癌癥中第二大癌，我國前列腺癌的發病率逐年升高，前列腺癌后期往往發展為去勢抵抗型前列腺癌及全身多處轉移，使得治療困難〔1〕。試驗證明，中國傳統醫藥在前列腺癌中已顯現出獨特的優勢，許多中藥提取物可以發揮抗前列腺癌的效果〔2〕。紫花地丁為堇菜科堇菜屬多年生草本植物，是中醫治療過程中應用較為廣泛的一種中藥材，其含有多種化學成分，具有廣泛的藥理作用，如抗炎、抑菌、抗病毒、抗腫瘤等〔3〕。研究報道紫花地丁全草水提物能夠降低乳腺癌細胞MCF-7和肝癌細胞HepG2的細胞活力，抑制癌細胞且能誘導癌細胞凋亡〔4〕。紫花地丁對U14荷瘤鼠腫瘤組織生長具有明顯的抑制作用〔5〕。然而紫花地丁對前列腺癌細胞凋亡、侵襲及遷移的影響及其機制尚不清楚。長鏈非編碼(lnc)RNA已被證明在包括前列腺癌在內的各種類型的癌癥中異常表達，因此，lncRNA可作為前列腺癌的新型生物標志物和治療靶標〔6〕。同源盒D基因簇反義生長相關的長鏈非編碼RNA(HAGLR)也稱HOXD-AS1，研究報道HAGLR在前列腺癌組織中的表達水增高，與患者預后密切相關〔7〕。HOXD-AS1可促進前列腺癌的增殖，去勢抵抗和化學抵抗；敲低HOXD-AS1可以在體內和體外抑制去勢抵抗性前列腺癌細胞的增殖和化學耐藥性〔8〕。HOXD-AS1在神經膠質瘤組織和神經膠質瘤細胞系中上調表達；敲低HOXD-AS1抑制神經膠質瘤細胞遷移和侵襲〔9〕。本實驗旨在研究紫花地丁可能通過調控HAGLR對前列腺癌細胞凋亡、侵襲及遷移的影響。

1 材料與方法

1.1主要材料 細胞DU145購自上海冠導生物；DMEM培養基購自上海善然生物；MTT試劑盒、凋亡試劑盒購自日本同仁化學研究所；紫花地丁購自中國藥品生物制品檢定所；Transwell、Matrigel購自美國BD公司；熒光定量PCR試劑盒購自武漢科昊佳生物；RIPA蛋白裂解液購自北京康佳宏原生物；N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)、裂解半胱天冬酶(Cleaved-caspase)3抗體購自英國biorbyt公司。

1.2細胞處理與分組 DU145細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養基中培養。取對數期細胞，用紫花地丁20、40、80 μg/ml處理，為低、中、高劑量組，正常培養的細胞作對照組。將si-NC、si-HAGLR轉染DU145細胞，分別為si-NC組、si-HAGLR組。

1.3MTT檢測細胞活性 培養48 h各組細胞，按試劑盒操作，酶標儀490 nm處檢測吸光度(OD)值。

1.4流式細胞術檢測細胞凋亡 培養48 h各組細胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗按試劑盒操作，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5Transwell檢測細胞遷移和侵襲 各組細胞制成細胞1×104個/ml細胞懸液，取100 μl接種上室，培養24 h，經甲醛固定、結晶紫染色，顯微鏡下拍照并計數。細胞侵襲實驗上室加入Matrigel，凝固后接種細胞，之后同細胞遷移操作。

1.6實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測HAGLR表達水平 各組細胞提取總RNA，反轉錄cDNA行PCR擴增，相對表達量用2-ΔΔCt法計算。GAPDH為內參，HAGLR上游引物：5′-GGGAACCTCCAGAGATGACA-3′，下游：5′-CGGCTGACATTAGCTTCCTC-3′。

1.7Western印跡法檢測N-cadherin、E-cadherin、Cleaved-caspase3蛋白表達 提取各組細胞總蛋白，定量；進行電泳、轉膜、封閉；加一抗4℃孵育過夜，加二抗室溫孵育2 h，暗室曝光、定影；Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.8統計學方法 采用SPSS20.0統計學軟件進行t檢驗，單因素方差分析。

2 結 果

2.1紫花地丁對DU145細胞活性和凋亡的影響

中、高劑量組細胞OD值較對照組顯著低，凋亡率較對照組顯著高(P<0.05)；而低劑量組細胞OD值和凋亡率與對照組差異不顯著(P>0.05)，見圖1，表1。

圖1 紫花地丁促進DU145細胞凋亡

表1 紫花地丁抑制DU145細胞活性，誘導細胞凋亡及對DU145遷移侵襲的影響

2.2紫花地丁對DU145遷移侵襲的影響 中、高劑量組遷移、侵襲細胞數較對照組顯著低(P<0.05)；而低劑量組遷移、侵襲細胞數與對照組差異不顯著(P>0.05)，見表1。

2.3紫花地丁對DU145中HAGLR表達的影響 與對照組相比，中、高劑量組HAGLR表達水平顯著降低(P<0.05)；而低劑量組無明顯變化。見表1。

2.4干擾HAGLR對DU145細胞活性及凋亡的影響 與si-NC組相比，si-HAGLR組細胞OD值顯著降低，細胞凋亡率顯著升高(P<0.01)，見圖2，表2。

2.5干擾HAGLR對DU145遷移侵襲的影響 與si-NC組相比，si-HAGLR組遷移、侵襲細胞數顯著降低(P<0.05)，見表2。

2.6紫花地丁處理及干擾HAGLR對DU145中蛋白表達的影響 與對照組相比，中、高劑量組N-cadherin表達水平顯著降低，E-cadherin、Cleaved-caspase3表達水平升高，且呈劑量依賴性(P<0.05)；而低劑量組各蛋白表達水平無明顯變化(P>0.05)；與si-NC組相比，si-HAGLR組N-cadherin表達水平顯著降低，E-cadherin、Cleaved-caspase3表達水平升高(P<0.05)，圖3，表3。

圖2 干擾HAGLR可促進DU145細胞凋亡

表2 干擾HAGLR對DU145細胞活性、凋亡、遷移、侵襲的影響

1～6：對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、si-NC組、si-HAGLR組圖3 N-cadherin，E-cadherin和cleaved-caspase 3蛋白表達水平

表3 紫花地丁處理及干擾HAGLR對DU145蛋白表達的影響

3 討 論

研究顯示，中藥提取成分對前列腺癌細胞具有抗腫瘤作用，其治療前列腺癌具有巨大的潛力和發展空間〔10，11〕。研究報道紫花地丁提取物可以抑制高度轉移性人類肺癌細胞系A549細胞的侵襲〔12〕。紫花地丁改善了脂多糖誘導的小鼠急性肺損傷〔13〕。本實驗表明中、高劑量紫花地丁可抑制前列腺癌細胞DU145增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡；而低劑量的紫花地丁對前列腺癌細胞無影響。

已有研究表明HAGLR與前列腺癌的增殖及預后相關〔7，8〕。且研究報道HOXD-AS1在甲狀腺乳頭狀癌組織和細胞系中過表達，其高表達與臨床晚期，腫瘤大小，淋巴結轉移和遠處轉移有關；降低HOXD-AS1抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖，遷移和侵襲，并促進細胞周期停滯〔14〕。HOXD-AS1高表達促進卵巢癌細胞增殖，遷移和侵襲〔15〕。食管癌組織和細胞中HAGLR表達增加，下調HAGLR通過使miR-143-5p海綿化而抑制溶酶體相關膜糖蛋白(LAMP)3表達，從而抑制細胞增殖、侵襲、遷移和上皮-間質轉化(EMT)和腫瘤生長〔16〕。沉默HOXD-AS1可抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲，并誘導細胞周期阻滯〔17〕。本實驗提示，干擾HAGLR表達可抑制前列腺癌細胞DU145增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡。本實驗提示紫花地丁可能通過下調HAGLR抑制前列腺癌細胞增殖、侵襲及遷移，促進細胞凋亡。