水處理周期中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化

章 霞，徐志進(jìn)，李偉業(yè)，殷小龍，馬雪彬，陳 爽

(浙江省舟山市水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316000)

水產(chǎn)養(yǎng)殖總產(chǎn)量和集約化程度日益增加，我國(guó)養(yǎng)殖產(chǎn)量已占世界養(yǎng)殖產(chǎn)量的 60% 以上[1-2]，隨之而來(lái)的尾水處理問(wèn)題已經(jīng)成為研究的焦點(diǎn)。在目前的工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖中，生物濾池是重要的水處理環(huán)節(jié)。而微生物群落結(jié)構(gòu)是影響生物濾池的水處理效果的重要因素[3]，這使得研究水處理周期中的微生物群落結(jié)構(gòu)變化具有重要意義。

水處理系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)與養(yǎng)殖環(huán)境因子息息相關(guān)。陳琛等[4]研究發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖密度會(huì)顯著影響凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中微生物群落特征。程璐璐等[5]研究發(fā)現(xiàn)緩釋碳源生態(tài)基質(zhì)的添加可使系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)菌屬生物占比發(fā)生變化，假單胞菌(Pseudomonas) 占比增加，脫氮效果得到提高；包鵬等[6]研究發(fā)現(xiàn)低溶解氧可以引起較高的生物多樣性，而高溶解氧則更利于硝化功能菌(Proteobacteria菌門(mén)的Nitrosomonas菌屬、Nitrospirae菌門(mén)的Nitrospira菌屬)的富集。以上研究表明，養(yǎng)殖環(huán)境因子不僅會(huì)影響?zhàn)B殖對(duì)象的生理狀態(tài)，也會(huì)改變養(yǎng)殖環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)。

碳源的添加方式是反應(yīng)器運(yùn)行效果的影響因素之一。Ciggin等[7]研究表明分次添加碳源的方式比連續(xù)添加更加能促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)。張萬(wàn)友等[8]研究表明分次添加碳源的處理方式在處理序批式反應(yīng)器(sequencing batch reactor,SBR)中更加有利于提高反硝化效率。張?zhí)m河等[9]對(duì)碳源投加方式對(duì)SBR工藝脫氮速率的影響的研究結(jié)果也表明分次添加碳源能夠提高有機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)速率和總氮去除率。而碳源添加后在水處理周期對(duì)微生物群落多樣性結(jié)構(gòu)的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。該研究擬通過(guò)對(duì)配置黑石斑循環(huán)水人工廢水的水處理效果和微生物群落的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行研究，為今后深入開(kāi)展微生物菌落調(diào)控水處理效果提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料選取聚苯乙烯泡沫濾珠(EPS)作為生物濾料，放置在自行設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)易的循環(huán)水系統(tǒng)，進(jìn)行生物掛膜水處理。裝置上部為40 L的濾料桶(直徑25 cm，高81.6 cm)，其中裝有20 L濾料，下部為直徑120 cm、高70 cm的蓄水桶，盛放水體約400 L，通過(guò)水泵(流量2 600 L/h)實(shí)現(xiàn)下進(jìn)水、上出水循環(huán)，濾料∶水體體積比為1∶20。濾料圖和水處理裝置圖見(jiàn)圖1～2。

圖1 濾料聚苯乙烯泡沫濾珠數(shù)碼攝像

圖2 水處理裝置(單位：cm)

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1水處理試驗(yàn)。根據(jù)前期水處理掛膜試驗(yàn)條件配置黑石斑循環(huán)水人工廢水400 L[10]，使得水體指標(biāo)初始值氨氮(NH4+-N)約為2.5 mg/L，亞硝酸鹽(NO2--N)約為5 mg/L，磷酸鹽(PO43--P)約為0.5 mg/L，硝酸鹽(NO3--N)約為0.5 mg/L。添加葡萄糖71 g使得水體中總有機(jī)碳(TOC)約為80 mg/L(TOC-葡萄糖配制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=460.32x-1.922 1，R2=0.999 3)，初始碳氮比設(shè)置為T(mén)OC∶無(wú)機(jī)氮≈10∶1，設(shè)置3個(gè)重復(fù)開(kāi)展水處理試驗(yàn)，試驗(yàn)過(guò)程中不換水，試驗(yàn)周期為11 d。

1.2.2水質(zhì)測(cè)定。前6 d每天統(tǒng)一時(shí)間取樣測(cè)定水體中氨氮和亞硝酸鹽，后4 d，每隔1 d測(cè)定水中氨氮和亞硝酸鹽。氨氮測(cè)定采用GB 17378.4—2007次溴酸鹽氧化法，亞硝酸鹽測(cè)定采用GB 17378.4—2007萘乙二胺分光光度法，采用總有機(jī)碳分析儀 TOC-LCPH CN200測(cè)定水體中TOC濃度。

1.2.3水體中微生物多樣性檢測(cè)。每隔1 d取濾膜測(cè)定微生物多樣性。水體微生物取樣：每個(gè)桶各取水樣2 L，經(jīng)0.22 μm 濾膜過(guò)濾，每組混合為1個(gè)樣本。樣本記錄為D1、D3、D5、D7、D9、D11。

DNA提取并擴(kuò)增測(cè)序分析：采用DNeasy PowerSoil Kit(50)(MoBio)試劑盒提取DNA，并采用引物進(jìn)行16S rDNA V4高可變區(qū)的PCR擴(kuò)增，具體擴(kuò)增方法參照文獻(xiàn)[10]，擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析水質(zhì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007和SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和差異顯著性檢驗(yàn)(α=0.05)。測(cè)序數(shù)據(jù)由 Illumina miseq 測(cè)序獲得原始雙端測(cè)序數(shù)據(jù)，先需要進(jìn)行去雜、拼接、嵌合體序列處理，獲得較為優(yōu)質(zhì)的序列 valid tags，再進(jìn)行分類(lèi) OTU、系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)、Alpha和Beta 多樣性等分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水體中氨氮、亞硝酸鹽、TOC的變化由圖3可知，在水處理過(guò)程中，氨氮出現(xiàn)2個(gè)波峰，分別在第1天和第3天，在第2天氨氮的去除率可達(dá)63.0%，在第4天后氨氮趨于穩(wěn)定，最終去除率可達(dá)98.0%以上；亞硝酸鹽和TOC濃度呈下降趨勢(shì)，在第1天時(shí)下降速率最快，到第4天有輕微的增長(zhǎng)，后續(xù)下降后趨于穩(wěn)定，在第2天亞硝酸鹽去除率可達(dá)81.2%，TOC去除率為73.4%，最終去除率分別可達(dá)99.0%和95.0%以上。

圖3 水體中氨氮、亞硝酸鹽、TOC濃度變化

2.2 不同時(shí)間水體中細(xì)菌豐度及多樣性的變化從表1可以看出，在循環(huán)水處理周期中，微生物原始序列呈增長(zhǎng)再平緩最后下降的趨勢(shì)，有效序列在第3天(D3)顯著高于其他各組；操作分類(lèi)單元數(shù)量在第3天最少，為128，第5天(D5)之后為730以上，顯著高于第3天；通過(guò)比較3個(gè)樣品細(xì)菌豐富度情況，從Chao指數(shù)可以看出微生物豐富度在第9天(D9)最高，從Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)發(fā)現(xiàn)群落多樣性在第5天最高，最低的為第3天。

表1 不同時(shí)間水處理系統(tǒng)中細(xì)菌豐度情況

2.3 不同時(shí)間水體微生物Alpha多樣性指數(shù)分析和物種間相似性的變化從Rank Abundance曲線可以看出樣品所含物種的豐富程度和均勻程度。曲線在橫軸上的長(zhǎng)度越寬表示物種組成越豐富，而在縱軸上跨度越小、曲線越平坦表示物種組成均勻程度越高。圖4表明，D3的微生物物種組成相較于其他各組最為豐富，最為均勻，其次是D1、D9。根據(jù)OTU注釋結(jié)果，繪制6個(gè)樣本的微生物物種間相似性的聚類(lèi)圖包括樣本間聚類(lèi)關(guān)系樹(shù)(圖5)，可以看出自第5天之后，水體中物種相似性越來(lái)越高。

圖4 不同時(shí)間運(yùn)行系統(tǒng)中細(xì)菌的豐富程度比較

圖5 不同時(shí)間循環(huán)水中微生物DNA樣本的相似性聚類(lèi)

2.4 不同時(shí)間水體微生物在門(mén)、屬分類(lèi)層面的變化

2.4.1在門(mén)分類(lèi)層面的變化。從表2可以看出，整個(gè)周期中，隨著水處理時(shí)間的延長(zhǎng)，各個(gè)時(shí)間段的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌在門(mén)分類(lèi)上變化不大，變形菌門(mén)在水體中占主要優(yōu)勢(shì)，擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)不同時(shí)間點(diǎn)有所差異。第1天(D1)細(xì)菌豐富度排列前5的門(mén)類(lèi)為變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)；第3天(D3)細(xì)菌豐富度排列前5的門(mén)類(lèi)為變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)、TM6；第5天(D5)細(xì)菌豐富度排列前5的門(mén)類(lèi)為變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)、TM6、藍(lán)藻菌門(mén)；第7天(D7)細(xì)菌豐富度排列前5的門(mén)類(lèi)為變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)、TM6、Gracilibacteria；第9天(D9)細(xì)菌豐富度排列前5的門(mén)類(lèi)為變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)、TM6；第11天(D11)細(xì)菌豐富度排列前5的門(mén)類(lèi)為變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)、Gracilibacteria。在水處理周期內(nèi)，微生物群落組成占比呈現(xiàn)一定的變化趨勢(shì)。水體中的變形菌門(mén)在前3 d占比達(dá)95.00%以上，第5天之后從77.79%逐漸下降至63.67%；擬桿菌門(mén)在第5天時(shí)急劇增長(zhǎng)，并在后續(xù)時(shí)間段波動(dòng)維持；厚壁菌門(mén)在第7天后呈現(xiàn)增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，第9天約為第7天的32倍。放線菌門(mén)先下降后上升再下降，在第3天占比最低，第7天最高；TM6呈先升高后降低的趨勢(shì)，在第5天最高。

表2 不同時(shí)間水處理中細(xì)菌(門(mén))的群落組成相對(duì)百分比

2.4.2在屬分類(lèi)層面的變化。從表3可以看出，水體中細(xì)菌豐富度屬類(lèi)差異較大。第1天(D1)，細(xì)菌豐富度排列前5的屬類(lèi)依次為遠(yuǎn)洋桿菌屬、發(fā)光桿菌屬、弧菌屬、Candidatus_Aquiluna、Owenweeksia；第3天(D3)，細(xì)菌豐富度排列前5的屬類(lèi)依次為弧菌屬、遠(yuǎn)洋桿菌屬、蛭弧菌屬、Fabibacter、發(fā)光桿菌屬；第5天(D5)，細(xì)菌豐富度排列前5的屬類(lèi)依次為遠(yuǎn)洋桿菌屬、蛭弧菌屬、弧菌屬、Fabibacter、Candidatus_Aquiluna;第7天(D7)，細(xì)菌豐富度排列前5的屬類(lèi)依次為遠(yuǎn)洋桿菌屬、弗朗西斯氏菌屬、弧菌屬、Candidatus_Aquiluna、蛭弧菌屬；第9天(D9)，細(xì)菌豐富度排列前5的屬類(lèi)依次為遠(yuǎn)洋桿菌屬、弗朗西斯氏菌屬、擬桿菌屬、糞桿菌屬、Owenweeksia；第11天(D11)，細(xì)菌豐富度排列前5的屬類(lèi)依次為遠(yuǎn)洋桿菌屬、擬桿菌屬、糞桿菌屬、Owenweeksia、弗朗西斯氏菌屬。在水處理周期內(nèi)，微生物群落組成占比呈現(xiàn)一定的變化趨勢(shì)。遠(yuǎn)洋桿菌素在第1天時(shí)占比最高，為69.76%，第3天迅速下降，第5天后逐漸升高，到第11天占比為40.83%，低于第1天；弧菌屬在第1天占比為2.97%，第3天迅速增至98.07%，第5天下降至8.38%，到第11天占比僅為0.47%；蛭弧菌屬在前3 d 呈現(xiàn)低占比,為0.08%～0.16%，第5天呈現(xiàn)一個(gè)峰值，占比為18.53%，第7天后逐漸下降；弗朗西斯氏菌屬前9 d呈現(xiàn)增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，第11天下降；擬桿菌屬在第9天有所增長(zhǎng)，第11天占比達(dá)6.87%。

表3 不同時(shí)間水處理中細(xì)菌(屬)的群落組成相對(duì)百分比

3 討論與結(jié)論

變形菌門(mén)(Proteobacteria) 通常是水環(huán)境中主要的原核生物，包含了光營(yíng)養(yǎng)型、化能自養(yǎng)型和化能異養(yǎng)型細(xì)菌，這類(lèi)細(xì)菌在水環(huán)境中普遍存在，相關(guān)報(bào)道指出在濕地、養(yǎng)殖廢水和深海沉積物等環(huán)境中以第一優(yōu)勢(shì)門(mén)存在[11-12]。從該試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，在整個(gè)水處理過(guò)程中，變形菌門(mén)都保持第一優(yōu)勢(shì)菌門(mén)的存在(占比63.67%～99.68%)；而在11 d的水處理中，水體中的擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)呈快速增長(zhǎng)，變形菌門(mén)占比逐漸下降，由變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)構(gòu)成了水體中的優(yōu)勢(shì)菌，有研究表明厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)存在一種相互促進(jìn)的共生關(guān)系，且能降解水體中的蛋白質(zhì)、糖類(lèi)等物質(zhì)[13-14]。推測(cè)是水體中的糖類(lèi)促進(jìn)了厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)的生長(zhǎng)，而氮元素比例的減少，是變形菌門(mén)相對(duì)豐度下降的主要原因[15]。此外水體中藍(lán)藻菌門(mén)在第5天占比達(dá)到峰值，之后則占比逐漸下降，推測(cè)藍(lán)藻菌門(mén)與水體中的氮元素有密切關(guān)系，前期可能是因?yàn)樗w中豐富的氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽為藍(lán)細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖提供了便利[16]，后期是因?yàn)樗w中碳源、氮源的消耗而造成其相對(duì)豐度下降。

眾所周知，弧菌病是海水養(yǎng)殖中最常見(jiàn)、流行廣、危害大的一類(lèi)疾病[17]。例如，哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)可以感染海洋脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物，引發(fā)魚(yú)蝦感染發(fā)病，造成大量死亡[18]。而在此次試驗(yàn)中，在水處理的第3天，水體中弧菌屬暴發(fā)性的增長(zhǎng)，細(xì)菌(屬)的群落組成相對(duì)百分比為98.07%，此時(shí)水體中氨氮也達(dá)到了第二次峰值，推測(cè)水體中弧菌屬細(xì)菌的生長(zhǎng)與氨氮濃度之間具有密切相關(guān)關(guān)系；在第5天和第7天，所占百分比分別為8.38%和2.35%，第9天和第11天分別為0.63%和0.47%。蛭弧菌屬在第5天群落占比最高，在7 d后逐漸下降。蛭弧菌是一種短時(shí)間內(nèi)侵染和裂解弧菌、氣單胞菌等革蘭氏陰性致病菌的小型寄生性細(xì)菌，同時(shí)可有效控制水體中氨氮、亞硝酸鹽、硫化物等有害物質(zhì)的含量，達(dá)到改良水質(zhì)的目的[19-20]。

綜上所述，由EPS泡沫濾珠作為生物濾料構(gòu)建的水處理系統(tǒng)具有較好的廢水處理能力，氨氮、亞硝酸鹽、TOC的最終去除率分別可達(dá)98.0%、99.0%和95.0%以上。系統(tǒng)處理第5天后，水質(zhì)情況趨于穩(wěn)定。而在該試驗(yàn)條件運(yùn)行中，發(fā)現(xiàn)水體中的微生物豐富度在第9天最高，群落多樣性在第5天最高，整個(gè)周期中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌在門(mén)分類(lèi)上變化不大，變形菌門(mén)在水體中占主要優(yōu)勢(shì)，推測(cè)其在水處理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。