二代測(cè)序用于藥品微生物檢測(cè)潔凈區(qū)環(huán)境菌庫的建立

孫榮嶸，徐晨，劉洋，任曉偉

濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，濟(jì)南 250102

藥品的質(zhì)量安全與控制關(guān)乎著人們的生命安全。近年來，藥品微生物污染如“欣弗事件” “刺五加事件”等都對(duì)社會(huì)造成了重大的危害與損失。2015～2017年，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）公布的藥品召回事件中，因微生物污染風(fēng)險(xiǎn)導(dǎo)致的召回占總召回事件的50%［1］。各種事件和案例都提示我們對(duì)藥品微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)控制不能大意。由于微生物的分布特點(diǎn)是分散的、不均一的，現(xiàn)行《中國(guó)藥典》（2020年版）［2］規(guī)定：“供試品檢出控制菌或其他致病菌時(shí)，按一次檢出結(jié)果為準(zhǔn)，不再?gòu)?fù)試。”但出于謹(jǐn)慎的考慮，藥品微生物檢驗(yàn)過程中的陽性結(jié)果除了樣品本身的原因外，有必要排除實(shí)驗(yàn)室人員、環(huán)境等因素引入的污染。如果能對(duì)藥品微生物檢測(cè)潔凈區(qū)（以下簡(jiǎn)稱“潔凈區(qū)”）環(huán)境微生物的群落分布及組成進(jìn)行充分了解，建立潔凈區(qū)的環(huán)境菌庫，并對(duì)出現(xiàn)的污染菌進(jìn)行溯源分析，可以在一定程度上有效地避免“假陽性”報(bào)告的出現(xiàn)，并可以制定有效的清潔消毒程序、規(guī)范檢驗(yàn)人員在潔凈區(qū)的行為等［3］，以期提高檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時(shí)還可以為生產(chǎn)企業(yè)的潔凈環(huán)境控制提供重要的參考。

目前，利用分子生物學(xué)手段進(jìn)行的微生物檢測(cè)較傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)及生化水平上的手工鑒定在時(shí)效性和準(zhǔn)確性上有著較大的優(yōu)勢(shì)，當(dāng)前實(shí)驗(yàn)室中采用16S rRNA測(cè)序方法已成為微生物檢測(cè)的重要手段［4］。國(guó)內(nèi)已有很多報(bào)道采用16S rRNA測(cè)序建立了環(huán)境菌庫［3，5］。但是16S rRNA測(cè)序的缺點(diǎn)是其雖然在種屬級(jí)別具有較高的準(zhǔn)確度，但到了菌株級(jí)別，其區(qū)分能力會(huì)大大下降。因此，有部分研究提示該種方法在同種不同分離株內(nèi)的分辨能力有限［6］，并且一些芽孢桿菌屬的微生物，如枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌等存在16S rRNA序列的高度相似性，也限制了16S rRNA測(cè)序在基因分型中的應(yīng)用［7］。而2020年版《中國(guó)藥典》四部通則“9204 微生物鑒定指導(dǎo)原則”在微生物溯源分析中指出，菌株水平的鑒定在污染調(diào)查過程中非常重要［8］，并給出了全基因組測(cè)序在藥品污染溯源分析中的重要指導(dǎo)意義。因此，本研究嘗試在4個(gè)月內(nèi)，周期性地從潔凈區(qū)收集環(huán)境微生物并采用BBL CRYSTAL細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行生化鑒定，而后采用Miseq二代測(cè)序儀進(jìn)行全基因組測(cè)序，以期獲得更精確的潔凈區(qū)環(huán)境微生物群落組成信息，并初步建立本實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境菌庫。

藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（good manufacturing practice，GMP）中要求有關(guān)藥品質(zhì)量控制的微生物檢驗(yàn)必須要有驗(yàn)證程序［9］。因此，本研究采用實(shí)驗(yàn)室保存的標(biāo)準(zhǔn)菌株作為質(zhì)控菌株。而本實(shí)驗(yàn)建立標(biāo)準(zhǔn)菌株菌庫的另一原因還在于藥品微生物檢驗(yàn)的方法學(xué)驗(yàn)證中標(biāo)準(zhǔn)菌株的使用不可避免，因此即使不同實(shí)驗(yàn)室交叉污染的可能性很低，在陽性菌的溯源分析中也最好排除實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)菌株傳入污染的可能性。因此，本研究旨在建立潔凈區(qū)環(huán)境菌庫的同時(shí)，建立了本實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)菌株菌庫，為今后污染菌的溯源分析提供更全面可靠的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

PBS 100浮游菌采樣器（蘇州諾達(dá)凈化科技有限公司）；BX51光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；SHP-350生化培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；BBL CRYSTAL AutoReader細(xì)菌鑒定儀（美國(guó)BD公司）；C1000 Touch PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；QIAxcel Advanced毛細(xì)管電泳儀（德國(guó)Qiagen公司）；Qbuit 3.0核酸蛋白測(cè)定儀（美國(guó)Invitrogen公司）；Miseq二代測(cè)序儀（美國(guó)Illumina公司）。

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（北京奧博星生物科技有限公司）。試劑盒：革蘭氏染色試劑盒（青島海博生物科技有限公司）；High Pure PCR Template Preparation Kit（美國(guó) Roche 公司）；Plant/Fungi DNA Isolation Kit（美國(guó)Sigma公司）；QIAxcel DNA Screening Kit（德國(guó)Qiagen公司）；Nextera XT Library Prep Kit、Miseq v2 Reagent Kit（美國(guó)Illumina公司）。本實(shí)驗(yàn)室保存的標(biāo)準(zhǔn)菌株：大腸埃希菌［CMCC(B)44102］、沙門菌［CMCC(B)50094］、銅綠假單胞菌［CMCC(B)10104］、枯草芽孢桿菌［CMCC(B)63501］、金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26003］、白念珠菌［CMCC(F)98001］、黑曲霉［CMCC(F)98003］購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；生孢梭菌［CMCC(B)64941］購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株的生化鑒定

取實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌、沙門菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和生孢梭菌，劃線接種到胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板，于33℃培養(yǎng)18h后，選取相應(yīng)的鑒定試劑盒，通過BBL CRYSTAL細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行種屬鑒定，采用甘油冷凍法,將鑒定后的細(xì)菌連同白念珠菌、黑曲霉置于冰箱冷凍保存。

1.3 環(huán)境微生物的采集

連續(xù)4個(gè)月采用浮游菌采樣器、表面接觸皿、沉降菌平皿從潔凈區(qū)不同區(qū)域（空氣、設(shè)備、生物安全柜、墻面、地面等）采集取樣。共收集細(xì)菌19株和霉菌1株。

1.4 環(huán)境微生物的生化鑒定

將采集的潔凈區(qū)環(huán)境微生物進(jìn)行培養(yǎng)、分離純化和染色鏡檢后，對(duì)其進(jìn)行初步分類。將純化的細(xì)菌劃線接種到胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板，于33℃培養(yǎng)18h后，選取相應(yīng)的鑒定試劑盒，通過BBL CRYSTAL細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行種屬鑒定，采用甘油冷凍法，將鑒定后的細(xì)菌連同收集的環(huán)境中的霉菌置于-80℃冰箱中保存。

1.5 Miseq二代測(cè)序

1.5.1 細(xì)菌DNA提取

依據(jù)細(xì)菌基因組提取試劑盒產(chǎn)品說明書對(duì)6種標(biāo)準(zhǔn)菌株及收集到的環(huán)境中的19株細(xì)菌進(jìn)行全基因組DNA抽提，利用Qbuit核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)細(xì)菌基因組DNA濃度后保存待用。

1.5.2 真菌DNA提取

依據(jù)真菌提取試劑盒產(chǎn)品說明書對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株白念珠菌、黑曲霉及所收集的環(huán)境中的1株霉菌進(jìn)行全基因組DNA提取，利用Qbuit核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)真菌基因組DNA濃度后保存待用。

1.5.3 建庫及上機(jī)

利用DNA文庫制備試劑盒進(jìn)行標(biāo)記基因組DNA、擴(kuò)增標(biāo)記后的DNA、純化擴(kuò)增后的DNA等步驟后，利用Qbuit核酸蛋白測(cè)定儀和毛細(xì)管電泳儀分別檢測(cè)制備文庫的濃度和片段大小分布，建庫成功后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化文庫及混合文庫。制備完成后利用Miseq二代測(cè)序儀對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株及所收集的潔凈區(qū)環(huán)境微生物菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用CLC軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，完成各菌株堿基序列的拼接，提交到美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI，www.ncbi.nlm.nih.gov /genbank)，選取DNA序列相似度最高的菌株結(jié)果作為比對(duì)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 潔凈區(qū)環(huán)境微生物和標(biāo)準(zhǔn)菌株生化鑒定結(jié)果

對(duì)收集的潔凈區(qū)環(huán)境微生物菌株進(jìn)行初步染色鏡檢，利用BBL CRYSTAL細(xì)菌鑒定儀對(duì)收集到的環(huán)境中的細(xì)菌和標(biāo)準(zhǔn)菌株（細(xì)菌）進(jìn)行生化鑒定。見表1和表2。

表1 環(huán)境微生物生化鑒定結(jié)果

表2 標(biāo)準(zhǔn)菌株（細(xì)菌）生化鑒定結(jié)果

2.2 潔凈區(qū)環(huán)境微生物和標(biāo)準(zhǔn)菌株的全基因組分析

采用生物信息學(xué)方法對(duì)菌株的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)拼接，生化鑒定結(jié)果同二代測(cè)序的結(jié)果。見表3。

表3 2種鑒定方法分析結(jié)果對(duì)比

續(xù)表

2.3 潔凈區(qū)環(huán)境微生物的統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)潔凈區(qū)收集的環(huán)境微生物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，革蘭陽性球菌占70.0%；革蘭陽性桿菌占15.0%；革蘭陰性桿菌占10.0%；霉菌占5.0%。見圖1。

圖1 潔凈區(qū)環(huán)境菌的統(tǒng)計(jì)分析

3 討論

本研究從潔凈區(qū)分離出的環(huán)境微生物只有20株，菌株數(shù)量不多，分析原因可能與新建實(shí)驗(yàn)樓潔凈區(qū)啟用時(shí)間不長(zhǎng)有關(guān)。本研究潔凈區(qū)分布的細(xì)菌中革蘭陽性菌占絕大多數(shù)，其中又以微球菌屬和葡萄球菌屬為主，二者均是人體易攜帶污染的微生物；其次是芽孢桿菌屬，為消毒劑較難消殺的一類細(xì)菌，這與大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室潔凈區(qū)環(huán)境微生物的類型相似［7］。這也提示我們,在日常制定潔凈區(qū)的消毒規(guī)范時(shí)，應(yīng)注意控制潔凈區(qū)人員數(shù)量、消毒的頻次和消毒劑類型的使用，以確保潔凈區(qū)的環(huán)境微生物在可控范圍內(nèi)，不能影響藥品的微生物檢驗(yàn)工作。

從表3可以看出，藤黃微球菌和里拉微球菌用BBL CRYSTAL生代鑒定為2種菌，而二代測(cè)序鑒定結(jié)果分析均顯示為藤黃微球菌。在前期對(duì)2種細(xì)菌進(jìn)行革蘭染氏色鏡檢下的形態(tài)也有一些區(qū)別，藤黃微球菌鏡檢下細(xì)菌的著色較深，成四連體分布，而里拉微球菌的形態(tài)較小，不成明顯的四連體，提示在分類學(xué)上二者雖然同屬微球菌屬，卻分屬不同種［10］。測(cè)序通量與準(zhǔn)確度密切相關(guān)，全基因組測(cè)序分析后的結(jié)果不一致的原因可能是二代測(cè)序的通量不夠，導(dǎo)致準(zhǔn)確度下降。類似的情況是生化鑒定為假生殖道棒狀桿菌的菌株，二代測(cè)序?yàn)闊o菌水桿菌。因此，現(xiàn)階段認(rèn)為有必要聯(lián)合運(yùn)用多種手段對(duì)潔凈區(qū)環(huán)境微生物進(jìn)行鑒別和溯源［11］，可以大大地提高鑒定準(zhǔn)確度，對(duì)后續(xù)相關(guān)性研究也能起到積極作用。

藥品微生物檢驗(yàn)尤其是無菌檢驗(yàn)中，環(huán)境微生物的種類和數(shù)量是影響檢驗(yàn)結(jié)果的重大風(fēng)險(xiǎn)因素，直接關(guān)系著檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性［12］。因此，建立藥品檢驗(yàn)潔凈區(qū)環(huán)境微生物數(shù)據(jù)庫、完善陽性檢出菌溯源體系，對(duì)判斷污染菌來源、實(shí)施有效的潔凈環(huán)境控制非常必要［13］。全基因組測(cè)序由于有著較高的準(zhǔn)確度和分辨率，其在藥品微生物檢驗(yàn)陽性菌的溯源分析中有著較大的應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展?jié)摿Α１狙芯吭?個(gè)月的時(shí)間對(duì)潔凈區(qū)收集的環(huán)境微生物進(jìn)行收集、生化鑒定及二代測(cè)序，初步建立了近期潔凈區(qū)環(huán)境菌株菌庫和標(biāo)準(zhǔn)菌庫，后續(xù)會(huì)不斷更新和完善潔凈區(qū)的環(huán)境菌庫數(shù)據(jù)，動(dòng)態(tài)地反映近期潔凈區(qū)的環(huán)境微生物的分布情況，更好地進(jìn)行環(huán)境微生物的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，為藥品微生物檢驗(yàn)尤其是無菌檢驗(yàn)的污染調(diào)查及溯源分析提供技術(shù)支持。