文蛤防御素基因的克隆及其免疫表達(dá)特征研究

周燁

（通州區(qū)興仁鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村和社會(huì)事業(yè)局，江蘇 南通 226300）

防御素（Defensins）是一類陽(yáng)離子抗菌活性肽，廣泛存在于各種生物體中，是生物體先天免疫防御和適應(yīng)性免疫防御機(jī)制的重要組成部分[1-3]。通常防御素都是小分子肽，由12～50個(gè)氨基酸構(gòu)成，分子內(nèi)富含精氨酸和由半胱氨酸形成的分子內(nèi)二硫鍵[4]。最初在鱟（Tachypleus tridentatus）中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)具有79 aa的防御素基因，被命名為Big Defensin（MmBD），作為抗菌肽家族（AMPs）的一員，該基因具有顯著的抗菌活性[5]。隨后在多個(gè)軟體動(dòng)物中開展了big Defensin基因的相關(guān)研究，包括菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinesis）[6]、海灣扇貝（Argopecten irradians）[7]、美洲簾蛤（Mercenaria mercenaria）[8]、魁蚶（Scapharca broughtonii）[9]等。以上研究表明，big defensin基因在免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。目前在關(guān)于文蛤（Meretrix meretrix）的研究中，還未見該基因的相關(guān)報(bào)道。

文蛤，屬軟體動(dòng)物門，瓣鰓綱，簾蛤目，簾蛤科，文蛤?qū)伲俏覈?guó)沿海灘涂重要的經(jīng)濟(jì)貝類之一。但由于近年來(lái)沿海重工業(yè)的發(fā)展和臨港船舶運(yùn)輸?shù)龋斐珊Ｑ蟓h(huán)境污染，文蛤養(yǎng)殖病害不斷發(fā)生，由此造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也嚴(yán)重影響了貝類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。目前認(rèn)為，重金屬污染是近年漁業(yè)環(huán)境污染的公害之一，是導(dǎo)致貝類死亡的直接原因。有關(guān)重金屬對(duì)文蛤抗氧化酶影響的研究已有一些報(bào)道，任虹等[10]研究了鐵（Fe）、銅（Cu）、鋅（Zn）和鉛（Pb）等重金屬離子對(duì)文蛤肝臟過(guò)氧化氫酶（CAT）和細(xì)胞色素氧化酶（CCO）2種酶活性的影響；田鎮(zhèn)等[11]研究了在銅離子（Cu2+）脅迫下，不同群體文蛤超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活力的變化。但重金屬對(duì)文蛤防御系統(tǒng)分子機(jī)制的影響尚未見報(bào)道。現(xiàn)克隆了文蛤MmBD基因，分析其特征和組織分布規(guī)律，研究了在Cu2+脅迫下，該基因應(yīng)對(duì)環(huán)境壓力的免疫應(yīng)答變化，以期為文蛤免疫防御機(jī)制研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用文蛤來(lái)自江蘇省通州灣海區(qū)。選取4個(gè)健康成熟的文蛤個(gè)體，置于冰上麻醉，分別取其外套膜、鰓、肝胰腺、足、閉殼肌以及性腺等6個(gè)組織樣品。待文蛤性腺發(fā)育成熟后，進(jìn)行催產(chǎn)，獲取4細(xì)胞期、囊胚期、原腸胚、D形幼蟲、殼頂幼蟲和稚貝6個(gè)不同胚胎發(fā)育時(shí)期樣品。設(shè)置對(duì)照組與試驗(yàn)組，開展Cu2+脅迫試驗(yàn)。使用CuSO4·5H2O（AR）制備1 g/L Cu2+母液，設(shè)置Cu2+質(zhì)量濃度為0.5 mg/L的海水為試驗(yàn)組，不加Cu2+的正常海水為對(duì)照組，每組30個(gè)文蛤個(gè)體，并設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)。每個(gè)組分別于12、36和72 h取3個(gè)文蛤個(gè)體的鰓組織，均用液氮速凍，并置于-80℃冰箱中保存。

1.2 MmBD基因cDNA序列全長(zhǎng)克隆及序列分析

從轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中獲得MmBD的EST序列，采用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（RACE）進(jìn)行基因cDNA序列全長(zhǎng)克隆，設(shè)計(jì)3＇RACE和5＇RACE特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增（表1），將獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化、回收，隨后連接到pMD-18T（TaKaRa）載體，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α（TaKaRa）中克隆，將篩選的陽(yáng)性克隆送至生工生物有限公司測(cè)序，拼接獲得結(jié)果。使用ORF Finder、SMART、ExPASY、TMHMM等在線網(wǎng)頁(yè)和工具，開展序列結(jié)構(gòu)特征分析；使用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表1 試驗(yàn)所用引物

1.3 熒光定量分析

根據(jù)RNA提取純化試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒（天根）的說(shuō)明書，分別獲取各個(gè)組織的總RNA，測(cè)定OD260/OD280值、1.2%瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估RNA濃度和質(zhì)量，再將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，于-20℃保存。根據(jù)熒光定量預(yù)混試劑盒（天根）說(shuō)明書配置體系，同時(shí)設(shè)置ABI7300系統(tǒng)擴(kuò)增程序。每個(gè)cDNA樣品做3個(gè)平行，β-actin為內(nèi)參，擴(kuò)增產(chǎn)物的解離曲線分析保證擴(kuò)增質(zhì)量。熒光定量數(shù)據(jù)按照文獻(xiàn)[12]的2-ΔΔCt方法計(jì)算，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。使用SPSS 19.0軟件的單因素方差（One-Way ANOVA）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，在單因素方差分析的基礎(chǔ)上，采用Duncan多重比較法進(jìn)行分析，P＜0.05為結(jié)果差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 MmBD基因序列分析

采用RACE技術(shù)克隆獲得MmBD基因（Gen Bank:ON351576）的cDNA全長(zhǎng)序列，共758 bp，其中5＇非翻譯區(qū)（UTR）長(zhǎng)181 bp，3＇UTR長(zhǎng)214 bp，開放閱讀框（,ORF）長(zhǎng)363 bp，共編碼120氨基酸（圖1）。預(yù)測(cè)蛋白分子質(zhì)量為13.22 kD，理論等電點(diǎn)pI為7.55。MmBD的預(yù)測(cè)氨基酸序列包含1個(gè)信號(hào)肽（1～23 aa）、2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（7～24 aa,44～66 aa）、高度保守的Cys殘基C-X6-C-X3-C-X13（14）-C-X4-C-C和kex2樣蛋白酶（KEKR-AV）的裂解位點(diǎn)。預(yù)測(cè)蛋白前端信號(hào)肽區(qū)具有較強(qiáng)的疏水性，在成熟肽區(qū)均有疏水氨基酸和親水氨基酸分布（圖2）。預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)包含3個(gè)α螺旋和6個(gè)β折疊。氨基酸序列對(duì)比、系統(tǒng)進(jìn)化樹和系統(tǒng)進(jìn)化樹所用物種序列登錄號(hào)分別見圖3、4和表2。由圖3、4可見，文蛤MmBD基因與菲律賓蛤仔的親緣關(guān)系最近，先與菲律賓蛤仔聚為一支，再與牡蠣、貽貝聚為一大支，最后再與扇貝等軟體動(dòng)物聚為一大支。

圖1 文蛤Big Defesin基因cDNA全長(zhǎng)序列及其結(jié)構(gòu)特征

圖2 MmBD親水性與疏水性分析

圖3 文蛤與其他物種Big Defesin基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖4 文蛤MmBD與其他軟體物種Big Defesin基因氨基酸序列對(duì)比

表2 系統(tǒng)進(jìn)化樹所用物種序列登錄號(hào)

續(xù)表

2.2 MmBD基因的組織表達(dá)

使用qPCR（實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)）分析MmBD基因在文蛤不同組織中（性腺、鰓、外套膜、肝胰腺、閉殼肌、足）的分布規(guī)律，結(jié)果見圖5。由圖5可見，MmBD在所檢測(cè)的各個(gè)組織中均有表達(dá)，該基因在鰓組織中的表達(dá)量最高（P＜0.05），其次是在外套膜和肝胰腺，而在閉殼肌、性腺和足中的表達(dá)量較低。

圖5 MmBD基因在文蛤各組織的分布情況

2.3 MmBD基因在胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)

MmBD基因在文蛤不同胚胎發(fā)育時(shí)期（4細(xì)胞期、囊胚期、原腸胚、D形幼蟲、殼頂幼蟲和稚貝）表達(dá)見圖6。由圖6可見，MmBD基因在D形幼蟲期表達(dá)量最高（P＜0.05），其次是原腸胚期，稚貝期表達(dá)量最低（P＜0.05）。

圖6 MmBD在不同胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特征

2.4 Cu2+脅迫下MmBD基因的表達(dá)特征

高濃度Cu2+脅迫試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照組文蛤的MmBD基因表達(dá)量無(wú)顯著變化，試驗(yàn)組MmBD基因表達(dá)量明顯升高（圖7）。尤其是36和72 h，試驗(yàn)組MmBD基因表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。

圖7 MmBD基因在Cu2+脅迫下的表達(dá)規(guī)律

3 討論

克隆獲得了文蛤Big Defensin基因的cDNA全長(zhǎng)序列，結(jié)果顯示，該基因的氨基酸序列N末端是一段具有較強(qiáng)疏水性的信號(hào)肽序列（23 aa），主要起到引導(dǎo)防御素前體蛋白通過(guò)脂膜的作用[13]；C端包含1個(gè)高度保守的防御素結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)由6個(gè)特定位置的保守半胱氨酸殘基C-X6-C-X3-C-X13（14）-C-X4-C-C組成，這與魁蚶、紫貽貝、海灣扇貝等其他貝類的Big Defensin基因的結(jié)構(gòu)相似，都具有防御素基因家族的典型特征。由此推測(cè)，文蛤MmBD基因可能發(fā)揮著與其他物種Big Defensin基因相似的功能。

MmBD在不同組織中的表達(dá)結(jié)果顯示，MmBD在性腺、腮等6個(gè)組織中均有表達(dá)。這與魁蚶[9]、文昌魚（Branchiostoma japonicum）[14]、雜色鮑（Halitotis diversicolor）[15]等的研究結(jié)果相似，Big Defensin基因在不同組織中廣泛表達(dá)。文蛤MmBD基因在鰓中的表達(dá)量最高（P＜0.05），其次是外套膜和肝胰腺。在魁蚶中，Big Defensin基因在肝胰腺中表達(dá)量最高，隨后是鰓、性腺以及外套膜；在雜色鮑中，Big Defensin基因在肝胰腺中表達(dá)量最高，其次是外套膜、足和鰓。在雙殼貝類中，鰓組織的主要功能是過(guò)濾和呼吸作用，外套膜是暴露于外部環(huán)境最多的組織之一，是免疫防御的第一道防線；肝胰腺的主要功能是消化代謝，是一種重要的免疫組織，可合成免疫因子啟動(dòng)免疫反應(yīng)；這幾個(gè)組織對(duì)調(diào)節(jié)貝類自身的免疫機(jī)制至關(guān)重要，可有效抵抗外來(lái)有害物質(zhì)的入侵[16-17]。由此可推測(cè)，文蛤MmBD基因與其他物種的Big Defensin基因一樣，在鰓、外套膜和肝胰腺等組織器官中起到重要作用，在機(jī)體免疫中發(fā)揮重要功能。MmBD在不同胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)結(jié)果顯示，MmBD在原腸胚期表達(dá)量突然上升，D形幼蟲期表達(dá)量最高（P＜0.05）。文蛤幼體在原腸胚后期整個(gè)胚胎形態(tài)逐漸發(fā)生變化，形成擔(dān)輪幼蟲，隨后再變態(tài)形成D形幼蟲，D形幼蟲開始從外界攝食[18]，MmBD在在原腸胚期開始大量表達(dá)，主要在D形幼蟲期起到重要作用，這可能是MmBD基因在這一過(guò)程中對(duì)幼體自身開展的自我保護(hù)機(jī)制。

防御素主要參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)，具有多項(xiàng)免疫功能，是生物體防御系統(tǒng)的重要成分。多項(xiàng)研究報(bào)道，Big Defensin基因與軟體動(dòng)物免疫防御密切相關(guān)。文獻(xiàn)[7，19]研究表明，海灣扇貝和蛤仔（Venerupis philippinarum）面對(duì)細(xì)菌攻擊時(shí)，兩者血細(xì)胞內(nèi)的Big Defensin基因表達(dá)量顯著上調(diào)，顯示出該基因較強(qiáng)的抗菌活性；Li等[9]研究表明，魁蚶SbBDef1基因參與了自身的免疫應(yīng)答過(guò)程，細(xì)菌侵染后其血細(xì)胞和肝胰腺中的SbBDef1基因均出現(xiàn)大量表達(dá)。此外，三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）[20]、櫛孔扇貝（Chlamys nobilis）[21]等研究中顯示，Big Defensin基因同樣在自身的機(jī)體免疫中起到重要作用。本試驗(yàn)結(jié)果與以往的研究結(jié)果相似，文蛤MmBD基因在重金屬Cu2+脅迫下出現(xiàn)明顯上調(diào)，尤其是36和72 h時(shí)，試驗(yàn)組MmBD基因表達(dá)量約為對(duì)照組表達(dá)量的5倍，2組差異極顯著（P＜0.01）。此結(jié)果說(shuō)明，文蛤MmBD基因響應(yīng)Cu2+脅迫下的免疫應(yīng)答，該基因可能在文蛤抵御外界環(huán)境刺激時(shí)發(fā)揮一定功能，其免疫防御機(jī)制有待繼續(xù)深入研究。