腦源性神經營養因子Val66Met基因多態性及氧化應激水平與帕金森病震顫癥狀的相關性研究

曹春華，劉興國，王安駟

（九江市第三人民醫院神經內科，江西 九江 332000）

帕金森病（Parkinson's disease，PD）在65歲以上的老年人中發病率為1.5%，多由于神經退行性病變引起，且老年男性發病率高于女性[1]。PD臨床表現主要有運動遲緩、靜止性震顫、肌肉強直等運動癥狀和睡眠障礙、感覺障礙和運動遲緩等非運動癥狀，目前其發病機制尚未完全明確。已有研究表明，氧化應激是PD重要的發病機制之一，各種因素導致的體內活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除不及時，損傷中樞神經系統引發PD[2]。腦源性神經營養因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）與諸多神經系統疾病相關。研究證實，BDNF的Val66Met基因多態性與老年糖尿病患者認知功能損害、抑郁癥、阿爾海默茲病密切相關[3-5]，但Val66Met基因多態性與PD震顫程度的相關性國內鮮有報道。本研究擬檢測PD患者外周血BDNF水平與氧化應激標記物水平，并探究BDNF Val66Met基因多態性及氧化應激標記物丙二醛（malondialdehyde，MDA）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）與PD震顫癥狀評分的相關性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2019年10月至2021年3月本院收治的60例PD患者為研究組，另選取同時期于本院體檢中心60名健康體檢者為對照組。研究組男36例，女24例；平均年齡（71.49±4.82）歲，平均病程（3.67±0.76）年；對照組男38名，女22名，平均年齡（71.76±6.43）歲。兩組性別、年齡比較差異無統計學意義，具有可比性。本研究經本院醫學倫理委員會審核批準。患者及家屬均簽署知情同意書。

納入標準：符合2020年《中國帕金森病治療指南（第四版）》[1]中PD的診斷標準；年齡＞18歲，且＜80歲。排除標準：其他腦血管病或神經系統疾病者；冠心病、糖尿病及高血壓病者；患有特發性震顫者；患有脊髓疾病及周圍神經疾病者；存在嚴重認知障礙或溝通困難者。

1.2 方法

1.2.1 BDNF、MDA、SOD、GSH血清水平檢測抽取患者靜脈血5 ml，分離血清，采用硫代巴比妥酸法檢測MDA水平，采用邁瑞BS 350S全自動生化儀檢測血清SOD、GSH水平。

1.2.2 BDNF Val66Met基因多態性檢測抽取患者3 ml靜脈血置于抗凝管中，并分離血漿，提取血漿中總DNA。采用Real-time PCR對BDNF Val66Met基因進行檢測，F：5’-AAGAAGCAAACATCCGAGGACA-3’，R：5’-GGGATTGCACTTGGTCTCGTAG-3’，引物由北京華大公司合成。利用PCR限制性片段長度多態性技術擴增BDNF Val66Met基因。酶切產物用3%瓊脂糖凝膠電泳，跑膠完成后染色，根據電泳條帶遷移速率分析BDNF Val66Met基因多態性。

1.2.3 震顫癥狀評分根據帕金森氏病綜合評分表（unified Parkinson disease rating scaleupdsr，UPDRS）中震顫癥狀評價標準：無震顫為0分，輕度：輕度震顫或不常發生為1分；中度：震顫癥狀令人煩惱為2分；重度：震顫癥狀使部分活動受限為3分；非常嚴重：震顫癥狀使大部分活動受到影響為4分。

1.3 統計學方法采用Graphpad 7.0軟件進行統計學分析，符合正態分布計量資料采用“±s”表示，組間比較采用t檢驗，等級資料采用Z檢驗；Pearson相關性分析血清MDA、SOD、GSH水平與震顫評分的相關性；Logistic回歸分析血清氧化應激標記物與BDNF Val66Met基因多態性與PD的相關性。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清氧化應激標記物水平比較研究組患者血清MDA水平高于對照組，SOD及GSH水平低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組血清MDA、SOD、GSH水平比較（±s）Table 1 Comparison of serum MDA,SOD and GSH levels between the two groups(±s)

表1 兩組血清MDA、SOD、GSH水平比較（±s）Table 1 Comparison of serum MDA,SOD and GSH levels between the two groups(±s)

注：MDA，丙二醛；SOD，超氧化物歧化酶；GSH，還原型谷胱甘肽

組別研究組對照組t值P值例數60 60 MDA（μmol/L）46.72±4.26 16.33±1.26 52.989＜0.001 SOD（kU/L）72.46±8.28 126.85±9.46-33.512＜0.001 GSH（μmol/L）21.42±2.73 62.92±5.37-53.362＜0.001

2.2 PD患者血清MDA、SOD、GSH水平與震顫評分的Pearson相關性分析Pearson相關性分析顯示，研究組患者震顫評分與MDA水平呈正相關（r=0.742，P=0.000），與SOD、GSH水平呈負相關（r=-0.783、-0.684，P=0.000、0.006）。

2.3 PD患者BDNF Val66Met基因多態性與震顫癥狀程度的差異性比較研究組攜帶BDNF Val66Met等位基因A患者28例，等位基因G患者32例。等位基因A患者與等位基因G患者震顫癥狀程度比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 PD患者BDNF Val66Met基因多態性與震顫癥狀程度的差異性比較Table 2 Comparison of BDNF Val66Met gene polymorphism and degree of tremor symptoms in PD patients

2.4 Logistic回歸分析PD患者BDNF風險等位基因及氧化應激標記物與震顫程度的影響因素將氧化應激指標與BDNF風險等位基因A納入多因素Logistic回歸分析模型，變量賦值：MDA、SOD、GSH均采用實際測量值，BDNF等位基因A未攜帶=0，BDNF等位基因A攜帶=1。結果顯示，MDA、SOD、GSH異常表達及攜帶BDNF等位基因A是加重PD患者震顫癥狀的影響因素，見表3。

表3 Logistic回歸分析PD患者BDNF風險等位基因及氧化應激標記物與震顫程度的影響因素Table 3 Influencing factors of BDNF risk alleles,oxidative stress markers and tremor degree in PD patients by logistic regression analysis

3 討論

PD對老年人認知功能及運動功能均會產生較大程度損傷，但主要影響生命質量的是運動功能。震顫癥狀是PD患者的主要臨床表現，也是影響PD患者運動功能的主要原因[6-7]。但研究發現，患者震顫癥狀嚴重程度各不相同，目前研究尚未完全明確PD患者震顫癥狀表現差異的具體機制[8-9]。已有研究表明，當老年患者體內抑制氧化應激能力減弱時，多余的ROS可能通過破壞中樞神經細胞膜上脂質類大分子蛋白造成細胞變性、死亡，引發震顫癥狀，且可能通過破壞神經細胞傳到節點，造成乙酰膽堿傳遞紊亂引發運動功能障礙[10-11]。

本研究結果表明，研究組血清MDA水平高于對照組，SOD及GSH水平均低于對照組（P＜0.05），說明氧化應激確實與PD發病相關。為了證明PD患者氧化應激水平與震顫癥狀的相關性，本研究采用Pearson相關性檢驗結果表明，PD患者震顫評分與MDA水平呈正相關，與SOD、GSH水平呈負相關，說明氧化應激標記物的異常表達與患者臨床癥狀存在內部關聯。

基因多態性對疾病的影響是近年來研究的熱點，LEE等[12]研究通過臨床薈萃分析證實，BDNF 196 AA+AG基因分型在歐洲PD患者中存在易感相關性，而在亞洲患者中無明顯相關。國內對于PD與基因多態性的研究報道較少。本研究通過Realtime PCR檢測PD患者BDNF Val66Met基因，再通過凝膠移動速率對Val66Met基因多態性進行分析發現，60例PD患者中，等位基因A攜帶患者28例，等位基因G攜帶患者32例，約占50%，通過秩和檢驗分析證實，兩種等位基因攜帶患者震顫癥狀程度不同，等位基因A攜帶者震顫癥狀明顯較為嚴重，Logistic回歸模型進一步證實，氧化應激標記物MDA、SOD及GSH異常表達與BDNF等位基因A均為PD患者震顫癥狀嚴重程度的影響因素。

綜上所述，PD患者震顫癥狀程度可能與氧化應激及BDNF Val66Met基因多態性密切相關，值得進一步深入研究。