檢測吡咯里西啶生物堿輔助診斷肝竇阻塞綜合征

邵幼林 熊愛珍 張鎖才 吳劍明 馬春明 郭風彩 柳龍根

肝竇阻塞綜合征(HSOS)也稱作肝小靜脈閉塞病，是由各種原因導致的肝血竇、肝小靜脈和小葉間靜脈內皮細胞水腫、壞死、脫落進而形成微血栓，引起肝內淤血、肝損傷和門靜脈高壓的一種病死率很高的肝臟血管性疾病，其原因之一是攝入含有肝毒性吡咯里西啶生物堿(HPA)的草藥[1]。我國HPA相關HSOS (HPA-HSOS)主要是攝入菊三七根塊成分引起[2]。由于部分患者不能準確提供服藥史，更難正確提供服用草藥藥名，且包括蜂蜜、牛奶、肉、蛋和茶等眾多動植物性食物中檢測到HPA[3]，這些不確定性和隱蔽性為診斷和治療HPA-HSOS造成了極大的困難。本研究試圖通過檢測患者攝入物中的HPA成分達到診斷HPA-HSOS的目的。

資料與方法

一、研究對象

選擇2016年1月至2019年3月在常州市第三人民醫院5例住院患者。根據患者病史，入院時臨床特征、肝腎功能、凝血功能、血常規，結合彩超、增強CT或增強MRI影像學臨床初步診斷為HSOS。排除布加綜合征、病毒性肝炎、自身免疫性肝病、非酒精性脂肪性肝病和遺傳代謝肝病。5例患者中1例服用物為菊三七葉，另外4例服用物的三七成分并不明確。故對5例患者服用物進行HPA成分檢測。

二、實驗方法

(一) 試劑與材料 色譜級乙腈購自Fisher公司，色譜級甲酸銨購自美國Sigma-Aldrich公司，色譜級氨水(25%)購自美國ROE SCIENTIFIC INC公司。分析純甲酸、甲醇購自上海國藥集團化學試劑有限公司。超純水由Milli-Q純水儀(Millipore, Bedford, MA, 美國)制備。千里光菲靈堿、千里光堿、千里光菲靈堿氮氧化物和千里光堿氮氧化物對照品購自成都普瑞法有限公司，純度大于98%。 菊三七堿甲和菊三七堿甲氮氧化物由課題組前期從菊三七中分離純化[4]，純度均大于80%。

(二) 樣品制備 藥材烘干(60℃)或晾干(常溫)后打粉，過40目篩，取0.2 g藥材粉末，精密稱定，加40 mL 0.5%的甲酸水溶液，稱定重量，超聲(100 Hz)40 min，放冷，再稱定重量，用0.5%的甲酸水補足減失的重量，搖勻。靜置，取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾后0.5%甲酸水稀釋10倍即得。精密吸取藥酒1 mL，以0.5%甲酸水定容至50 mL，用0.22 μm微孔濾膜過濾即得。

(三) 儀器與分析條件 樣本含量測定參考文獻[5]，在Acquity Ultra Performance LCTM-Micromass ZQ 2000液質聯用儀上進行，該儀器配備ESI離子源，單四級桿質譜檢測器及MassLynx 4.1數據分析軟件。色譜條件：色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18 column (2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)，柱溫45 ℃，流動相10 mmol 甲酸銨水溶液(A)和乙腈(B)梯度洗脫，流速0.4 mL/min，進樣量2 μL。樣品槽溫度10 ℃。質譜條件：毛細管電壓3.5 kV，錐孔電壓40 V，離子源溫度150 ℃，去溶劑溫度400℃，錐孔氣流速50 L/h， 脫溶劑氣流速900 L/h。

結 果

一、患者一般情況

患者入院后完善肝腎功能、凝血功能、血常規和彩超、增強CT或增強MRI檢查。根據患者病史、入院后肝功能變化，采用RUCAM評分診斷藥物性肝損傷，3例為很可能，2例為可能。結合影像學檢查，臨床診斷疑似HSOS 3例，2例診斷為酒精性肝病和慢加急性肝衰竭。5例患者一般情況和入院首次實驗室檢查結果見表1、2。

二、所服可疑物中HPA

對于菊三七葉的根、莖、葉，及其他服用物中千里光菲靈堿、千里光堿、菊三七堿甲及其N-氧化物等6種主要HPA的含量檢測結果見表3。

表1 患者一般情況及轉歸

表2 患者入院首次主要檢驗結果

表3 患者攝入可疑物中HPA的含量

三、診斷、治療和轉歸

基于HPA檢測結果，4例患者診斷為HPA-HSOS，1例患者排除HSOS。確診HSOS的4例患者在護肝、支持、利尿、維持能量和水電解質平衡治療的基礎上均接受抗凝治療，最終2例存活，2例死亡。排除HPA-HSOS的1例患者避免抗凝治療，在常規護肝支持、血漿置換等治療下，病情持續進展，最終因肝衰竭行肝移植治療。

討 論

目前，在6000多種開花植物中已發現660個不同結構的含N-氧化物(PA)，其中在 C1 和 C2 之間具雙鍵的 PA表現出強烈的肝毒性、基因毒性、肺毒性、神經毒性[3]。在菊三七中鑒定出21種肝毒性較強的PA結構，其中千里光堿 、千里光菲靈堿、菊三七堿甲及其N-氧化物含量最高[5]。大部分PA本身無直接毒性，經肝臟細胞色素P450酶(cytochrome P450, CYP450)代謝，導致其1、2-不飽雙鍵斷裂產生 PA 自由基[6]，PA自由基可能損傷肝細胞，且肝竇內皮細胞的損傷更嚴重，導致危及生命的HSOS。我國HPA-HSOS主要是服用菊三七所致[7]。本研究收集了1例HSOS患者服用的菊三七全株，并檢測其干燥根、莖、葉中HPA成分，發現菊三七根、莖、葉中均含有HPA，HPA含量根>葉>莖。

目前診斷PA-HSOS主要依據病史、臨床表現、實驗室檢查和影像學檢查[7]。在我國，患者常將菊三七錯誤地用作三七的替代品，用以促進血液循環和消腫止痛，部分患者單純的用其保健，多數患者將菊三七浸泡酒中長期飲用[8]。

PA-HSOS患者ALT、AST和ALP在2倍正常值上限以下，導致RUCAM量表評分較低；如患者提供的用藥不準確，再次降低了評分，故采用RUCAM量表診斷HPA-HSOS存在缺陷。鑒于HSOS存在特異性的肝靜脈顯示不清、地圖狀、花斑樣不均勻強化等影像學特征[7]，常通過典型病史結合影像學檢查臨床診斷HSOS。然而，布加綜合征患者也存在類似改變，Kan等[9]報道布加綜合征患者CT檢查顯示28.07%存在斑片狀肝強化，19.30% 存在不均勻低衰減，因此病史模糊或攝入物難以辨認的患者臨床診斷需慎重。

Gao等[10]研究顯示，采用高效液相色譜-串聯質譜法測定患者血清中吡咯蛋白加合物 (pyrrole-protein adducts, PPA)對PA-HSOS具有較高的靈敏度和特異性，血PPA濃度與停用相關藥物時間、HSOS的嚴重程度及臨床轉歸有關。Xia等[11]報道了在動物試驗中可以采用PPA作為潛在的診斷標志物。在HSOS患者的血清和肝臟中也發現了PPA[12]。一組18例HSOS患者入院1個月后的血樣中均檢測到PPA，提示其可用作 PA 遺傳毒性的診斷生物標志物[13]。但對停藥時間很長就診的患者體內是否可以檢測到PPA不得而知，因此，使用PPA作為生物標志物仍需更深入研究。如能明確患者攝入物的成分亦有重要的參考價值。本研究發現2例服用三七粉和1例飲用三七酒中含有HPA，而1例影像學可疑HSOS患者服用的三七粉不含PA，排除PA-HSOS。

總之，服用菊三七葉與根塊一樣會導致典型的HSOS。對于能確切提供可辨識的食用藥物及病史的患者，結合影像學檢查一般臨床診斷較為可靠。但對于病史不詳細、攝入物難以辨認的患者，對其攝入物HPA檢查，有利于提高對HSOS的診斷、合理治療。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。