幾種主流恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)及其優(yōu)化策略進(jìn)展

蔡文凱，蔡水淋綜述 郝宗杰審校

1.廈門健康工程與創(chuàng)新研究院，福建 廈門 361013；

2.福建省水產(chǎn)研究所，福建 廈門 361000；

3.武漢蘭丁云醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430000

傳染性疾病DNA/RNA檢測(cè)是現(xiàn)代臨床診斷醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中一個(gè)重要問題，核酸擴(kuò)增是分子診斷的關(guān)鍵步驟。國(guó)家衛(wèi)生健康委發(fā)布《新型冠狀病毒肺炎診療方案》指出：核酸檢測(cè)是判斷患者有無(wú)2019-nCoV感染的直接證據(jù)，也是傳染性疾病預(yù)后的重要指標(biāo)[1]。目前，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)因其特異性強(qiáng)、靈敏度高成為最常見的核酸檢測(cè)方法。但因其檢測(cè)過(guò)程繁瑣、需要專業(yè)人員操作和設(shè)備昂貴等因素，限制了基層核酸檢測(cè)的運(yùn)用[2]。自20世紀(jì)90年代，科研人員一直致力于研發(fā)更簡(jiǎn)易高效核酸檢測(cè)方法，同時(shí)擺脫循環(huán)加熱儀器約束。核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)不需要溫度的轉(zhuǎn)換，擴(kuò)增實(shí)質(zhì)是模板RNA/DNA持續(xù)處于單鏈/單鏈缺口狀態(tài)，即可完成基因片段的置換擴(kuò)增[3]。這一特點(diǎn)簡(jiǎn)化了儀器需求，同時(shí)也縮短50%以上反應(yīng)時(shí)間，所以在急診等快速診斷場(chǎng)景中具有巨大的應(yīng)用價(jià)值，如今也成為分子診斷行業(yè)發(fā)展中的熱點(diǎn)。加之，恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與酸堿指示劑或側(cè)流層析試紙條技術(shù)結(jié)合等簡(jiǎn)化了檢測(cè)結(jié)果判讀，使得核酸的即時(shí)檢驗(yàn)?zāi)軌蛘嬲貙?shí)現(xiàn)。

恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)是在恒定溫度下采用非熱變性方法解開DNA雙鏈并完成核酸擴(kuò)增的技術(shù)，支持在同一個(gè)管中完成核酸擴(kuò)增和結(jié)果判讀全部檢測(cè)過(guò)程，具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。主流恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)包括：依賴核酸序列擴(kuò)增技術(shù)(NASΒA)、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(RCA)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)、解旋酶依賴擴(kuò)增(HDA)、重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)。這些技術(shù)逐漸用于臨床診斷、食品安全、轉(zhuǎn)基因農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。本文將介紹上述恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的原理及其在分子診斷的應(yīng)用，并重點(diǎn)闡述優(yōu)化恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的策略。

1 恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和PCR擴(kuò)增技術(shù)的實(shí)質(zhì)都是引物與單鏈模板DNA結(jié)合后，延伸擴(kuò)增目的片段，因此核酸擴(kuò)增反應(yīng)的第一步都是將非單鏈的起始序列進(jìn)行處理變成單鏈DNA模板。本文按DNA模板變性方式分為兩大類，一類為依靠高溫變性，例如NASΒA和SDA技術(shù)，雖然反應(yīng)過(guò)程中溫度恒定，但是初始階段需要95℃預(yù)變性過(guò)程；另一類依靠解旋酶或者甜菜堿等非高溫手段使DNA模板變性，核酸擴(kuò)增反應(yīng)全程處于單一溫度，徹底擺脫熱循環(huán)儀的制約，如RCA，HAD，RPA和LAMP等。6種恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)比較見表1。

表1 6種恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的比較

1.1 依賴核酸序列擴(kuò)增技術(shù)(NASΒA)1991年Compton模擬病毒RNA的逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制方式，發(fā)明了依賴核酸序列擴(kuò)增技術(shù)(nucleic acid sequence-based amplification，NASΒA)[4]。該項(xiàng)技術(shù)的原理是由一對(duì)含有T7 RNA聚合酶序列引物介導(dǎo)，三種酶(RNase H，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和T7 RNA聚合酶)共同作用單鏈RNA進(jìn)行擴(kuò)增，將反轉(zhuǎn)錄過(guò)程直接合并到擴(kuò)增反應(yīng)。NASΒA反應(yīng)包含了兩個(gè)階段(非循環(huán)相和循環(huán)相)，如圖1所示。其中非循環(huán)相(step 1～5)，起始由模板單鏈RNA合成RNA-DNA復(fù)合體，再轉(zhuǎn)化成含有T7 RNA聚合酶序列的雙鏈DNA。循環(huán)相(step 6～10)雙鏈DNA在T7RNA聚合酶作用下生成單鏈RNA進(jìn)入循環(huán)相，進(jìn)入反轉(zhuǎn)錄、降解、反轉(zhuǎn)錄，如此循環(huán)反復(fù)，單鏈RNA模板在2 h內(nèi)最多可擴(kuò)增1012倍。NASΒA擴(kuò)增技術(shù)特別適用于RNA病毒的檢測(cè)，例如艾滋病病毒、丙肝肝炎病毒，細(xì)菌和腸道病毒。美國(guó)FDA批準(zhǔn)NASΒA數(shù)字化芯片技術(shù)用于艾滋病毒RNA的快速檢測(cè)[5]。中國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局將NASΒA方法設(shè)為早期篩查禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)方法之一(GΒ/T19440-2004)。韓國(guó)Kainos公司也研發(fā)全自動(dòng)便攜式NASΒA檢測(cè)儀，使得NASΒA更適于疫情現(xiàn)場(chǎng)快速診斷。

圖1 六種恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)示意圖

1.2鏈置換擴(kuò)增術(shù)(SDA)1992年Walke提出鏈置換擴(kuò)增技術(shù)(strand displacement amplification，SDA)，這標(biāo)志著一種全新機(jī)制DNA擴(kuò)增技術(shù)的誕生。鏈置換擴(kuò)增(SDA)反應(yīng)體系關(guān)鍵性酶是HincⅡ酶和exo-klenow酶。SDA擴(kuò)增反應(yīng)涉及“切口-延伸-置換”循環(huán)往復(fù)的過(guò)程。鏈置換擴(kuò)增(SDA)原理如圖示，帶有nickase酶切位點(diǎn)引物結(jié)合到單鏈DNA模板后，延伸后被內(nèi)切酶酶切后生成3'端nickase缺口。另一組引物會(huì)在此缺口處發(fā)生新鏈聚合反應(yīng)，產(chǎn)生新DNA鏈同時(shí)置換出舊模板DNA鏈。舊鏈重新進(jìn)入SDA循環(huán)不斷重復(fù)，最終使得目標(biāo)基因大量擴(kuò)增。當(dāng)前SDA擴(kuò)增技術(shù)主要用于傳染病病原體定性檢測(cè)，不僅擴(kuò)增DNA病毒，也可以擴(kuò)增RNA病毒。趙錦等[6]采用等溫鏈置換擴(kuò)增檢測(cè)體系擴(kuò)增了登革熱病毒DENV，擴(kuò)增產(chǎn)物用納米金側(cè)流層析試紙條技術(shù)檢測(cè)，檢測(cè)敏感度為10 fmol/L。GIUFFRIDA等[7]將SDA檢測(cè)技術(shù)和微流控芯片技術(shù)結(jié)合，成功檢測(cè)出microRNA和DNA靶序列。

1.3 滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(RCA)滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)RCA(rolling circle amplification，RCA)是模擬自然界中環(huán)狀DNA生物滾環(huán)復(fù)制方式而建立的一種體外核酸恒溫?cái)U(kuò)增方法。RCA擴(kuò)增技術(shù)關(guān)鍵是構(gòu)建一個(gè)完整的單鏈環(huán)狀DNA和只能與單鏈環(huán)鏈DNA發(fā)生鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)的phi29 DNA聚合酶[8]。滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(RCA)原理如圖1所示，線狀DNA引物與單鏈DNA模板互補(bǔ)結(jié)合，然后T4 DNA連接酶作用下形成閉合單鏈環(huán)狀DNA模板，最后phi29 DNA聚合酶不斷延伸生成DNA新鏈并置換出舊鏈。被置換下來(lái)的舊鏈重新進(jìn)入循環(huán)過(guò)程，因此在1 h內(nèi)完成106～109核酸擴(kuò)增。RCA擴(kuò)增技術(shù)在病原微生物檢測(cè)、腫瘤早期篩查、DNA及RNA的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)、蛋白質(zhì)的檢測(cè)等方面都有著廣泛的應(yīng)用前景[9]。TENG等[10]利用RCA技術(shù)建立一種特異靈敏的快速檢水樣中副溶血性弧菌技術(shù)，檢測(cè)限達(dá)到1 CFU/mL。WANG等[11]利用RCA技術(shù)檢測(cè)血液中腫瘤標(biāo)記物MiR-21的異常表達(dá)。

1.4 解旋酶依賴擴(kuò)增(HDA)2004年，Vincent模擬自然界中DNA復(fù)制過(guò)程發(fā)明了解旋酶依賴擴(kuò)增技術(shù)(helicase-dependent amplification，HDA)。HDA反應(yīng)步驟與PCR相似，均包括DNA鏈解旋、退火及延伸等步驟，兩者最大的區(qū)別是HDA反應(yīng)用單鏈結(jié)合蛋白酶和解旋酶替代PCR升溫解旋雙鏈過(guò)程，因此HAD是一種徹底的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。解旋酶依賴擴(kuò)增(HDA)原理如圖1所示。Helicase解旋酶解開模板DNA雙鏈，再由單鏈結(jié)合蛋白酶(SSΒ)維持單鏈狀態(tài)，引物結(jié)合到單鏈DNA模板上延伸擴(kuò)增形成新雙鏈。反復(fù)循環(huán)擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)靶DNA量的指數(shù)增加，在60～90 min內(nèi)完成擴(kuò)增109～1012倍[12]。HAD具有靈敏度高、特異好等特點(diǎn)，在臨床診斷運(yùn)用方面有諸多報(bào)道，包括了麻疹病毒、副溶血性弧菌、沙門菌等病原體微生物的快速診斷[13]。王曉等[14]對(duì)比了HDA擴(kuò)增技術(shù)和qPCR檢測(cè)手段，結(jié)果表明HDA擴(kuò)增技術(shù)靈敏度比qPCR高10～100倍。

1.5 重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)2006年，NiallArmes第一次描述重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(recombinase polymerase amplification，RPA)。這種恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)主要依賴于三種酶：?jiǎn)捂満怂峤Y(jié)合重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和鏈置換DNA聚合酶。擴(kuò)增循環(huán)步驟如圖所示：重組酶和引物結(jié)合形成重組酶-引物復(fù)合物，結(jié)合到模板雙鏈DNA形成D-loop結(jié)構(gòu)D-loop一條單鏈與引物雜交啟動(dòng)DNA擴(kuò)增，引發(fā)鏈交換反應(yīng)。同時(shí)母鏈開始分離并最終形成兩個(gè)雙鏈體，將作為下一個(gè)周期的模板。RPA反應(yīng)速率非常快，一般可在10 min擴(kuò)增1012倍[15]。RPA技術(shù)在POCT有廣泛運(yùn)用，在病毒診斷、細(xì)菌檢測(cè)、SNP檢測(cè)、食品安全檢測(cè)、基因突變等方面的應(yīng)用進(jìn)展均有相關(guān)綜述[16-17]。ROHRMAN等[16]應(yīng)用RPA-LFD技術(shù)快速檢測(cè)干血漬中HIV病毒。KIM等[17]應(yīng)用RPA方法在10 min內(nèi)就可以直接特異地檢測(cè)到雞蛋和雞肉中沙門氏菌，靈敏度是實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的100倍。

1.6 環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)2000年，Notomi建立了環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop mediated isothermal amplification，LAMP)。該技術(shù)以其簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)、價(jià)格低廉等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)成為市場(chǎng)最成熟的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。2002年，NAGAMINE等[18]引入環(huán)引物，大大加速了整個(gè)鏈置換反應(yīng)過(guò)程，使得整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)縮短到30 min。技術(shù)核心原理是在65℃附近DNA雙鏈處于動(dòng)態(tài)平衡，即任何一個(gè)引物向雙鏈DNA進(jìn)行堿基配對(duì)延伸時(shí)，另一條鏈就會(huì)發(fā)生鏈置換反應(yīng)自動(dòng)解離變成單鏈。環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)分兩個(gè)階段：起始階段F3引物首先和模板結(jié)合并延伸，同時(shí)置換出互補(bǔ)單鏈，頸引物自我堿基配對(duì)形成莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)；擴(kuò)增循環(huán)階段以莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)為模板，啟動(dòng)鏈置換合成多環(huán)花椰菜結(jié)構(gòu)DNA片段，可在1 h內(nèi)積累109個(gè)拷貝。LAMP技術(shù)已經(jīng)廣泛檢測(cè)各種病原體檢測(cè)，相關(guān)國(guó)家行業(yè)安全標(biāo)準(zhǔn)多達(dá)20余條，如快速檢測(cè)志賀氏菌(SN-T2754.3-2011)等。目前也報(bào)道基于LAMP方法的新冠肺炎病毒檢測(cè)方法，HUANG等[19]利用RT-LAMP法將新冠RNA病毒逆轉(zhuǎn)錄和核酸擴(kuò)增同步進(jìn)行，快速檢測(cè)時(shí)間僅為30 min。設(shè)計(jì)了多重RT-LAMP引物可同時(shí)檢測(cè)了ORF1ab基因、E基因和N基因三個(gè)基因，使用臨床樣本驗(yàn)證特異性可達(dá)100%。日本榮研化學(xué)株式會(huì)研發(fā)了商品化LAMP檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)結(jié)果與PCR一致。

2 優(yōu)化策略

恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)作為一類新型核酸分子診斷技術(shù)，有著共同技術(shù)通?。捍蠖嗪銣?cái)U(kuò)增技術(shù)是多種酶復(fù)合反應(yīng)體系，而酶處于非最適反應(yīng)溫度時(shí)，酶活力將下降甚至引起負(fù)面效果，例如限制性內(nèi)切酶會(huì)發(fā)生引起非特異性切割、聚合酶堿基錯(cuò)配延伸概率增高等[20]；其次恒溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)沒有溫度變化，局部復(fù)雜結(jié)構(gòu)DNA雙鏈并未完全打開，或者重復(fù)序列也會(huì)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，又或者引物與互補(bǔ)片段在低溫情況下錯(cuò)誤配對(duì)等，某些情況下的反應(yīng)體系里引物之間形成非特異性互補(bǔ)，最后造成假陽(yáng)性的結(jié)果；再者樣本來(lái)源復(fù)雜，鼻咽拭子或血漿等樣本往往含有擴(kuò)增反應(yīng)抑制物，這會(huì)降低擴(kuò)增靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性差。本文從大分子擁擠效應(yīng)、核酸結(jié)構(gòu)、酶穩(wěn)定性和其他技術(shù)聯(lián)用等策略優(yōu)化恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系，以提高核酸擴(kuò)增反應(yīng)效率、特異性和靈敏性。

2.1 擁擠試劑擁擠試劑模擬了自然狀態(tài)下細(xì)胞的高度擁擠狀態(tài)，擁擠試劑提高了酶促反應(yīng)速率，加快了酶反應(yīng)速度[21]。在恒溫核酸擴(kuò)增中，常用的擁擠試劑包括聚乙二醇、多聚蔗糖等。MOTRé等[22]在HDA反應(yīng)中額外添加5%多聚蔗糖400，可以縮短一半的反應(yīng)時(shí)間。SASAKI等[23]發(fā)現(xiàn)RCA擴(kuò)增產(chǎn)物與聚乙二醇添加量成正比，其機(jī)制可能是聚乙二醇有助于探針和模板結(jié)合，從而顯著提高聚合酶活性。鐘文濤等[24]認(rèn)為擁擠試劑環(huán)境影響了蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，通過(guò)非折疊狀態(tài)變?yōu)檎郫B狀態(tài)來(lái)增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性，降低蛋白酶反應(yīng)的自由能提高酶活性。

2.2 模板結(jié)構(gòu)恒溫條件容易導(dǎo)致單鏈DNA形成局部二級(jí)結(jié)構(gòu)(或發(fā)夾結(jié)構(gòu))，引物自身二聚體和非特異性擴(kuò)增，因此如何使雙螺旋解鏈DNA變性成單鏈模板，成為提高特異性擴(kuò)增的關(guān)鍵因素之一。甜菜堿可幫助DNA聚合酶順利通過(guò)DNA某些復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)(如高GC區(qū)域)，防止DNA聚合酶的從模板中解離。LUO等[25]發(fā)現(xiàn)引物如果沒有經(jīng)過(guò)嚴(yán)格篩選，RPA技術(shù)中很容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。但是在RPA反應(yīng)體系中添加0.8 mol/L甜菜堿，可以提高RPA檢測(cè)的靈敏性和準(zhǔn)確性，從而有效檢測(cè)到臨床血漿樣本中的乙型肝炎病毒。單鏈結(jié)合蛋白(SSΒs)非特異性與單鏈DNA結(jié)合，使模板處于單鏈狀態(tài)防止單鏈形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，并且保護(hù)單鏈部分不被核酸酶降解。ZHOU等[26]研究CRISPR-SDA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)時(shí)，發(fā)現(xiàn)缺少SSΒ蛋白，引物的3'末端很難結(jié)合到dsDNA，從而影響下一步擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。MIKAWA等[27]在RAC擴(kuò)增中添加SSΒ蛋白，不僅加速反應(yīng)速率并且減少背景信號(hào)。

2.3 酶穩(wěn)定性核酸檢測(cè)過(guò)程中必須減少樣本中內(nèi)源抑制物的干擾作用。這些內(nèi)源抑制物(包括血紅素，蛋白酶等)可以抑制了酶活性和破壞酶結(jié)構(gòu)，最終造成擴(kuò)增產(chǎn)物少或假陰性。牛血清白蛋白(ΒSA)因富含賴氨酸，可通過(guò)疏水鍵相互作用力消除了多酚類化合物，以降低了抑制物的干擾作用。WALKER等[28]研究認(rèn)為牛血清白蛋白通過(guò)可與酚類化合物和多糖結(jié)合，避免聚合酶失活，優(yōu)化SDA反應(yīng)體系。LIN等[29]研究了不同濃度的ΒSA在數(shù)字LAMP的優(yōu)化作用，結(jié)果表明1 mg/mLΒSA可以達(dá)到最佳的檢測(cè)效果；他認(rèn)為ΒSA通過(guò)保護(hù)酶的穩(wěn)定性降低引物二聚體形成，最終提高反應(yīng)特異性。海藻糖通過(guò)抗氧化、熱、干燥、脫水等不利外界因素來(lái)保護(hù)酶的穩(wěn)定性，最終顯著地提高酶的熱穩(wěn)定性和活性。WAN等[30]利用LAMP技術(shù)檢測(cè)沙門氏菌時(shí)，不僅發(fā)現(xiàn)添加5.0%海藻糖可以縮短將近20%的反應(yīng)時(shí)間。此外，海藻酸酶是凍干反應(yīng)混合物的酶穩(wěn)定劑，李美霞等[31]結(jié)果表明海藻糖作為保護(hù)劑機(jī)理：海藻糖與蛋白酶表面殘余水分子結(jié)合，使蛋白酶構(gòu)象更穩(wěn)定。

2.4 與其他技術(shù)結(jié)合恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與CRISPR-Cas系統(tǒng)結(jié)合。CRISPR蛋白具有特異性地精確定任何雙鏈DNA序列，具有高特異性。目前CRISPR/Cas系統(tǒng)主要技術(shù)平臺(tái)是DETECTR技術(shù)(Cas12a)和SHERLOCK技術(shù)(Cas13a)[32]，這兩種CRISPR技術(shù)均可與RAP擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合，先通過(guò)RAP技術(shù)將核酸目標(biāo)進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，再用CRISPR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。該技術(shù)已經(jīng)成功檢測(cè)出如病毒檢測(cè)(ZIKA)和病毒亞型區(qū)分(HPV)，達(dá)到信號(hào)擴(kuò)增為目標(biāo)序列初始濃度的104倍效果。恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與電化學(xué)生物傳感器結(jié)合：與傳統(tǒng)檢測(cè)(化學(xué)發(fā)光，電泳檢測(cè)、免疫試紙條法)方法相比較，與恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)結(jié)合所構(gòu)建的生物傳感器測(cè)速度快、靈敏度高，低背景，甚至達(dá)到單分子檢測(cè)水平。YANG等[33]利用SDA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和電化學(xué)信號(hào)放大技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)microRNA超靈敏檢測(cè)，最低檢測(cè)限達(dá)到0.64 fmol/L。基于納米材料的電化學(xué)生物傳感器大大提高了檢測(cè)的靈敏度，也提高了傳感器的特異性和重現(xiàn)性。謝順碧[34]通過(guò)電化學(xué)的方法間接追蹤LAMP中產(chǎn)生的磷酸根離子(Pi)實(shí)現(xiàn)家蠶微孢子蟲PTP1基因的高靈敏檢測(cè)，其檢測(cè)限達(dá)17 fg/μL。

3 展望

恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)具有擴(kuò)增快、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)簡(jiǎn)便、無(wú)需專用設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)成本較低，有望在基層醫(yī)療及POCT中得到廣泛運(yùn)用，是目前新冠肺炎核酸快速檢測(cè)中最具潛力的檢測(cè)手段之一，特別是LAMP技術(shù)已逐漸應(yīng)用于檢測(cè)中。除上述恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)存在假陽(yáng)性缺陷的情況下，仍有一些問題亟待解決。首先恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的結(jié)果一般都是定性，無(wú)法準(zhǔn)確定量檢測(cè)。有些文獻(xiàn)提出用標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)定量，但是因?yàn)殒溨脫Q酶具有指數(shù)擴(kuò)增，很難得到滿意的定量結(jié)果；其次不同公司的恒溫核酸擴(kuò)增檢測(cè)體系和設(shè)備不具有兼容性，影響了技術(shù)大規(guī)模推廣和應(yīng)用；而且恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)對(duì)核酸模板要求較低，并不需要將待測(cè)樣本完全將核酸純化。因此不少研究人員嘗試用粗提取核酸樣本或者免提取核酸直接擴(kuò)增樣本?？偠灾?，恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)是一類具有突破性的、快速而簡(jiǎn)單的核酸診斷工具。經(jīng)過(guò)持續(xù)優(yōu)化和改善，恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)必定和PCR技術(shù)一樣成為新冠肺炎核酸不可缺少的檢測(cè)方法。