藥用復合膜原料膜及添加物體外細胞毒性研究

洪燕，游媛，劉寧，龔瑋，鄭洋濱

江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，江西 南昌 330029

細胞毒性檢查法是將供試品或者供試品接觸細胞，通過對細胞形態、增殖和抑制影響的觀察，評價供試品對體外細胞的毒性作用，常用的方法有MTT 法、細胞計數法、碘化丙碇（PI）染色法等［1］。《國家藥包材標準》中細胞毒性可分為相對增殖度法、瓊脂擴散法、直接接觸法和浸提法4 種［2］。

藥用復合膜由各種塑料與紙、金屬或者其他材料通過層合擠出貼面、共擠塑等工藝技術將基材結合在一起而形成的多層結構的膜，可用于直接接觸各類藥物制劑的包裝，是藥品的重要組成部分，厚度一般不大于0.25 mm［3-4］。在藥用復合膜的生產過程中，為了改善膜材的質量及品質，或有利于加工生產，須加入一些化學助劑，如增塑劑、穩定劑、成核劑等［5］。復合膜在生產時會涂布黏合劑使不同的膜材進行復合，使用最多的為聚氨酯類膠黏劑，其中存在的芳香胺和有機溶劑也為有毒物質。其次大部分印刷的油墨中含有有毒有害物質，包括重金屬、有機揮發物、殘留的溶劑等等，這些均存在安全隱患［6］。

基于目前對復合膜原料的細胞毒性研究尚不完善，本次實驗采用MTT 法，對18 種復合膜原料、2 種黏合劑添加物及9 種油墨添加物進行細胞毒性研究，為藥包材質量的監督管理提供依據。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

L929 細胞（ATCC）、MTT［3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基四唑鹽溴化物］、1640完全培養基、胎牛血清、生理鹽水、二甲基亞砜（DMSO）。

1.2 儀器

電子天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］，酶標儀（賽默飛世爾科技公司），CO2恒溫培養箱（賽默飛世爾科技公司），倒置顯微鏡（奧林巴斯株式會社）。

1.3 實驗樣品

試驗選取6個廠家的不同批號復合膜18批（PET膜、PE 膜、VMPET 膜），黏合劑添加物2 種（2,4-二氨基甲苯、2,6-二氨基甲苯）和油墨添加物9 種［熒光增白劑KSN、熒光增白劑378、1,4-二（2-氰苯乙烯）苯、1,4-二（2-苯并唑基）萘、4,4,-雙（2-苯并唑基）二苯乙烯、2,5-雙（苯并唑-2-基）噻吩、7-二乙氨基-4-甲基香豆素、2,5-二(5-叔-丁基-2-苯并唑基)噻吩、熒光增白劑135］共29 個樣本。

2 實驗方法

2.1 MTT 溶液的配制

取MTT 500 mg 溶于100 mL PBS 緩沖液中，濃度為5 mg/mL，過濾除菌，4 ℃避光保存。

2.2 樣品浸提液的制備

見表1。

表1 供試品前處理

2.3 細胞毒性增殖度實驗方法

取正常生長并處于對數生長期的L929 細胞，消化吹打計數，稀釋至濃度為1×104/mL，精密吸取100 μL 細胞懸液注入細胞培養板內，放入含5%的CO2的恒溫培養箱中37 ℃培養24 h。棄去原培養液，換成各種供試液，每組6 孔，同時設立陽性對照組（10% DMSO），陰性對照組（聚丙烯輸液袋浸提液），空白對照組（1640 完全培養基各100 μL 每孔），再置細胞培養箱中37 ℃繼續培養，同步實驗。72 h 后，小心吸棄孔內上清液，每孔加入20 μL 濃度為5 mg/mL 的MTT 溶液，繼續孵育培養4 h 后終止培養。小心吸棄孔內上清液，每孔分別加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分溶解，在酶標儀上用雙波長（570 nm、630 nm）測定各孔吸光度，計算相對增殖度（RGR），RGR=供試品吸光度/空白對照組吸光度×100%［7］。

2.4 結果判定標準

樣品的細胞毒性可采用細胞毒性分級表評價，見表2。

表2 細胞毒性分級表

3 實驗結果

3.1 不同浸提條件對復合膜原料膜細胞毒性的影響

結果顯示用3 種不同的浸提方法進行試驗，RGR 值測定結果在80～110，細胞毒性分級在0～1，呈現無毒或輕微毒性，見表3。

表3 不同條件下復合膜原料膜細胞毒性試驗結果 %

3.2 黏合劑添加物細胞毒性測定及比較

根據黏合劑添加物不同濃度的細胞增殖度，用SPSS 軟件計算半抑制濃度（IC50）［8-9］。結果顯示，2,4-二氨基甲苯在高濃度下（10～0.156）mg/mL 顯示出極強的細胞毒性，毒性分級在3～4 級；隨著稀釋倍數的增加（0.078～0.039）mg/mL，細胞毒性逐漸降低，毒性分級基本在1～2 級，呈現出輕微毒性。2,6-二氨基甲苯同樣在高濃度下（10～0.625）mg/mL 下顯示出極強的細胞毒性，毒性分級在3～4級；隨著稀釋倍數的增加（0.313～0.039）mg/mL，細胞毒性逐漸降低，毒性分級基本在1～2 級，呈現出輕微毒性。不同浸提條件下，2,4-二氨基甲苯IC50值（0.06 9～0.124 mg/mL），均小于2,6-二氨基甲苯IC50值（0.370～0.566 mg/mL）,顯示2,4-二氨基甲苯的L929 細胞毒性大于2,6-二氨基甲苯。見表4。

表4 黏合劑添加物不同浸提條件RGR和IC50測定結果

3.3 油墨添加物細胞毒性測定及比較

根據油墨添加物不同濃度的細胞增殖度，用SPSS 軟件計算IC50。結果顯示在37 ℃浸提條件，生理鹽水為浸提介質下，8 種添加物在各個濃度下均無細胞毒性，毒性分級基本在1～2 級，呈現出輕微毒性；1 種添加物7-二乙氨基-4-甲基香豆素在高濃度時下（10，5）mg/mL 顯示出細胞毒性，毒性分級在3～4 級；細胞毒性隨稀釋倍數的增加逐漸降低，毒性分級基本在0～2 級，呈現出輕微毒性或無毒。在37 ℃浸提條件，完全培養基為浸提介質下，6 種添加物在各濃度下無細胞毒性，毒性分級基本在1～2 級，呈現出輕微毒性。3 種添加物［熒光增白劑378，1,4-二（2-氰苯乙烯）苯，7-二乙氨基-4-甲基香豆素］在高濃度時呈現出細胞毒性，毒性分級在3～4 級，細胞毒性隨稀釋倍數的增加逐漸降低，毒性分級基本在0～2 級，呈現出輕微毒性或無毒。在121 ℃浸提條件，生理鹽水為浸提介質下7 種添加物在各濃度下無細胞毒性，毒性分級基本在1～2 級，呈現出輕微毒性。2 種添加物［1,4-二（2-苯并唑基）萘，7-二乙氨基-4-甲基香豆素］在高濃度時呈現出細胞毒性，毒性分級在3～4 級，細胞毒性隨稀釋倍數的增加逐漸降低，毒性分級基本在0～2 級，呈現出輕微毒性或無毒。見表5。

表5 油墨添加物不同浸提條件RGR測定結果

4 結論

復合膜原料膜用3種不同的浸提方法進行試驗，細胞毒性分級在0～1，呈現無毒或輕微毒性。說明該類產品安全可靠。

黏合劑添加物試驗結果顯示，黏合劑添加物在37 ℃的浸提條件下顯示出比121 ℃更強的細胞毒性，121 ℃浸提條件下的IC50值明顯高于37 ℃浸提條件的IC50值。

油墨添加物結果表明，較高濃度的油墨添加物7-二乙氨基-4-甲基香豆素在不同的浸提條件及浸提介質下均表現出細胞毒性作用。在37 ℃浸提條件，培養基為浸提介質下更有利于有毒物質的浸出，而表現出更強的細胞毒性。

藥用復合膜是固體制劑的主要包裝材料,可用于直接接觸各類藥物制劑，是藥品的重要組成部，為保證其使用的安全，減少不良反應的發生，應在其原有標準中增加細胞毒性檢查項。