不同分離方法對紅托竹蓀菌種的復壯效果

黃曉潤,黃萬兵*,劉傾城,盧穎穎,朱國勝,桂 陽

（1.貴州省農作物品種資源研究所，貴州 貴陽 550006；2.貴州省食用菌育種重點實驗室，貴州 貴陽 550006；3.貴州省食用菌現代農業產業技術體系資源育種功能實驗室，貴州 貴陽 550006；4.貴州省食用菌工程技術研究中心資源育種實驗室，貴州 貴陽 550006）

紅托竹蓀（Dictyophora rubrovolvata）目前主要分布于我國貴州、云南、四川等西南地區，其營養豐富，味道鮮美，是貴州省的特色珍稀食用菌，具較高的營養和經濟價值[1-4]。菌種退化是食用菌生產中存在的普遍問題[5-6]，菌種退化勢必會影響菌種質量與產量。菌種退化分為可逆和不可逆兩類，其中，可逆的退化可通過復壯恢復優良特性，通常采用的復壯方法有菌絲尖端分離法、子實體組織分離法和原生質體再生法等[7-8]。紅托竹蓀在栽培過程中常出現菌絲退化、菌種老化，出菇延遲，導致產量嚴重下降。為避免紅托竹蓀優良性狀的退化，以保存1年的紅托竹蓀菌株為主要試驗材料，利用菌絲尖端分離法、竹蛋組織分離法和子實體組織分離法進行復壯，以期篩選出紅托竹蓀復壯的最佳方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 保存1年的紅托竹蓀菌株，編號分別為2182、yzs020、1907，由貴州省農作物品種資源研究所真菌研究室提供。

1.1.2 培養基 木屑培養基配方為葡萄糖5 g、果糖25 g、蛋白胨2.5 g、硫酸銨2.5 g、維生素B60.16 g、瓊脂8 g、木屑70 g（60目篩）、土豆100 g、玉米粉20 g、蒸餾水1 000 mL，pH自然。

1.2 試驗方法

1.2.1 尖端分離法 采用菌絲尖端分離法，將紅托竹蓀2182、yzs020、1907 接種于木屑培養基平板，長到2 cm 后挑取尖端部分1 cm的菌絲再次接種于木屑培養基平板；對照（CK）為保藏種直接接種于木屑培養基平板。

1.2.2 竹蛋組織分離法 將種植的紅托竹蓀竹蛋用75%酒精擦洗表面，在無菌室超凈工作臺紫外燈照射10 min 后進行組織分離，接種于木屑培養基平板，挑取菌蓋、菌裙、菌柄、膠質層、菌托膜5個部位的組織，接入木屑培養基平板培養觀察[9]。

1.2.3 子實體組織分離法 將種植的紅托竹蓀子實體用75%酒精擦洗表面，在無菌室超凈工作臺紫外燈照射10 min 后進行組織分離，接種于木屑培養基平板，挑取菌蓋、菌裙、菌柄、膠質層、菌托膜5個部位的組織，接入木屑培養基平板培養觀察[9]。

1.3 指標測定

挑取約0.5 mm×0.5 mm 的組織塊，置于培養基上22℃培養。每組分離方法及CK均設5 個平板重復，每天定時觀測，記錄萌發時間、菌絲生長速度、菌絲長勢、萌發率及污染率。

2 結果與分析

2.1 紅托竹蓀尖端分離菌絲體的生長情況

由表1可知，CK 菌絲長勢稀疏；尖端分離后2182、yzs020、1907 菌絲體的長勢強于CK，均為生長濃密。生長速度CK 最低，為0.96 mm/d；尖端分離后的菌株均高于CK，其中，yzs020 生長最快，為1.19 mm/d。尖端分離后菌絲體萌發率、萌發時間、污染率一致，分別為100%、24 h、0%。

表1 紅托竹蓀尖端分離菌絲體的生長情況

2.2 紅托竹蓀竹蛋組織分離菌株的生長情況

由表2 可知，接種菌蓋組織除2182 菌株全部污染（污染率達100%）外，1907 菌株、yzs020菌株的菌絲長勢、生長速度相同，均為菌絲生長密、0.21 mm/d。1907 菌株污染率為60%，yzs020 菌株全萌發。菌株萌發時間yzs020為48 h，1907菌株為24 h。

表2 紅托竹蓀竹蛋組織分離菌株的生長情況

菌裙組織2182 菌株、yzs020 菌株、1907菌株菌絲長勢均為生長密，菌絲生長速度分別為0.25 mm/d、0.29 mm/d、0.17 mm/d。2182 菌株、yzs020 菌株全萌發，1907 菌株萌發80%。2182 菌株、yzs020 菌株萌發時間均為24 h，1907菌株萌發時間較慢，為456 h。

菌柄組織2182菌株、yzs020菌株、1907菌株菌絲長勢均為生長密，菌絲生長速度分分別為0.29 mm/d、0.32 mm/d、0.22 mm/d。2182菌株、yzs020菌株全萌發，1907菌株萌發40%。萌發時間均為24 h。

膠質層組織2182 菌株、yzs020 菌株、1907 菌株菌絲長勢均為生長稀疏，菌絲生長速度分別為0.14 mm/d、0.22 mm/d、0.17 mm/d。2182菌株萌發80%，yzs020菌株全萌發，1907 菌株僅萌發20%。萌發較慢，2182 菌株、yzs020 菌株萌發時間分別為216 h、192 h，1907菌株為24 h。2182菌株污染率為20%。

菌托膜組織2182 菌株、yzs020 菌株、1907 菌株菌絲長勢均為生長濃密，菌絲生長速度分別為0.34 mm/d、0.35 mm/d、0.23 mm/d。3個菌株全萌發，萌發時間均為24 h。

2.3 紅托竹蓀子實體分離菌株的生長情況

由表3 可知，菌蓋組織2182 菌株、yzs020菌株、1907菌株全部污染（污染率達100%）。

表3 紅托竹蓀子實體分離菌株的生長情況

菌裙組織除1907 菌株未萌發外，2182 菌株、yzs020 菌株的菌絲長勢均為生長密，生長速度分別為0.22 mm/d、0.20 mm/d，萌發率、萌發時間均分別為20%、24 h。2182菌株污染率為80%。

菌柄組織除1907菌株全部污染（污染率達100%）外，2182菌株、yzs020菌株的菌絲長勢均為生長密，生長速度分別為0.24 mm/d、0.22 mm/d。2182菌株、yzs020菌株萌發率分別為40%、100%，萌發時間均為24 h。2182菌株污染率為60%。

膠質層組織2182 菌株全部污染（污染率達100%）、yzs020 菌株未萌發。1907 菌株菌絲長勢為生長稀疏，生長速度0.21 mm/d，萌發率為20%，萌發時間72 h，污染率為80%。

菌托膜組織2182 菌株、yzs020 菌株、1907 菌株菌絲長勢均為生長濃密，菌絲生長速度分別為0.34 mm/d、0.35 mm/d、0.35 mm/d。萌發率yzs020 菌株為100%，2182 菌株、1907 菌株為80%。萌發時間均為24 h。2182 菌株、1907 菌株污染率均為20%。

3 結論與討論

食用菌菌種的衰老主要與自身遺傳變異和環境因素相關。自身遺傳主要包括變異和基因突變等；環境因素主要包括培養條件不適宜、菌種保藏環境不適合、菌種保藏不當和菌株被病毒感染等[10-11]。針對紅托竹蓀及其他食用菌菌種老化、衰老最主要的預防措施，其基本原則就是“預防為主”，減少環境因素帶來的影響，保證菌種的質量，因此不能考慮單一因素，需要從多方面進行預防。對退化菌種，可采取定期查看剔除退化菌種、定期分離純化、創造適合的培養基質及環境條件、控制菌種的傳代次數等措施入手[12]。

采用尖端分離技術分離時，3 株復壯菌株長勢為生長濃密；生長速度為1.09～1.15 mm/d，復壯菌株生長速度明顯高于保存1年的對照菌株（0.96 mm/d）；萌發率、萌發時間、污染率一致，分別為100%、24 h、0%。尖端分離的菌絲體進行復壯效果最好，這可能與尖端分離后菌絲體內潛伏或感染的雜菌顯著下降，菌絲體對培養料的分解力、適應性增強有關[13-15]。但由于多次尖端分離之后，可能會造成菌絲體發生變異等情況，因此該種方法可用于短期內的菌株復壯，食用菌的傳代次數一般不得超過5次[16]。

紅托竹蓀竹蛋組織分離復壯時，菌托膜部位分離的萌發率最高，3 個菌株全萌發，萌發時間較快，均為24 h；菌絲生長速率較快，2182 菌 株、yzs020 菌株和1907 菌株 分別為0.34 mm/d、0.35 mm/d 和0.23 mm/d，且沒有污染，但由于竹蛋未形成完整的子實體，無法知曉其農藝性狀的優勢，所以通過竹蛋的菌托膜復壯可能不是較佳的菌株。

紅托竹蓀子實體進行組織分離復壯時，其菌蓋、菌裙、菌柄因暴露在外，導致其被污染的概率大大增加，通過菌落形態特征初步判斷常被霉菌、枯草芽孢桿菌等菌污染，菌托膜和膠質層因有部分包裹在內，所以污染的概率相對較小，菌托膜部位分離的萌發率相對較高，yzs020 菌株全萌發，2182 菌株和1907 菌株萌發率均為80%；污染率也較低，僅20%；萌發時間24 h；菌絲生長速度較快，為0.34～0.35 mm/d。

在紅托竹蓀菌株復壯中，目前采用的方法主要有菌絲尖端分離法和組織分離法，研究只對復壯菌株菌絲的一些生長指標進行測定，對于紅托竹蓀的尖端分離最佳次數，尖端分離和組織分離復壯之后的農藝性狀特征還有待進一步深入研究。