miR-499a-5p通過靶向TLR2抑制缺氧/復氧誘導的心肌細胞氧化應激和凋亡

楊偉，王雁，李俊杰，王燕瓊，陳文棟

(昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院麻醉科，云南 昆明 650032)

急性心肌梗死是臨床上常見的心血管疾病，由于冠狀動脈內斑塊破裂、血栓形成導致冠狀動脈血管閉塞、心肌細胞缺血缺氧損害[1]。然而心肌細胞在長時間缺血缺氧狀態(tài)下可導致細胞內線粒體功能障礙，啟動氧化應激反應，激活細胞凋亡途徑，最終引起心肌細胞損害[2]。因此，抑制氧化應激反應、降低心肌細胞凋亡率對減輕心肌細胞缺血缺氧損傷的具有重要意義。近年來，微小RNA(miRNA)在人類疾病中的作用已經逐漸受到大量研究的認可，尤其在心血管疾病中的作用[3]。Zhu等[4]指出，miR-499a-5p下調可能與心肌細胞缺氧發(fā)生氧化應激反應，并誘導心肌細胞凋亡途徑相關，然而其具體作用靶點研究尚未完善。Toll樣受體2(Toll-like receptors 2，TLR2)是一種參與非特異性免疫的蛋白分子，其通過識別不同病原體相關分子模式，激動信號級聯(lián)反應，進而促進免疫應答[5]。Zhang等[6]指出，miR-499可能參與IPostC的心臟保護，通過抑制局部和全身TLR2激活、炎癥和PKC信號傳導。因此，本研究擬探討miR-499a-5p與TLR2的靶向關系，并分析其對缺氧/復氧誘導的心肌細胞氧化應激和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠心肌細胞H9c2(購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物公司)；杜氏細胞培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(購自Hyclone公司)；pGL3-Basic質粒載體(購自上?？道噬锟萍加邢薰?；脂質體Lipofectamine3000(購自Invitrogen公司)；實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒(購自日本TaKaRa公司)；B淋巴細胞瘤因子2XL(Bcl2-xL)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)的第一抗體(購自abcam公司)，丙二醛(MDA)(S0131S)、超氧化物歧化酶(SOD)(S0103)、活性氧(ROS)(PS835)試劑盒、雙熒光素酶報告基因、miR-499表達檢測試劑盒(均購自上海碧云天研究所)；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素-碘化丙啶(V-FITC/P1)凋亡檢測試劑盒(購自南京森貝伽生物科技有限公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)、模型建立及分組干預

將H9c2細胞株置于5%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基進行常規(guī)培養(yǎng)傳代，取對數(shù)期心肌細胞進行分組干預，每組干預條件重復5次：(1)對照組心肌細胞置于常氧培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)；(2)將其余細胞置于1% O2、94% N2、5% CO2條件下缺氧處理3 h，在37 ℃ 5% CO2條件下復氧培養(yǎng)6 h，制造缺氧/復氧模型細胞，設為模型組；根據(jù)實驗設計情況，將細胞分為miR-NC組、miR-499a-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-499a-5p組、miR-499a-5p+pGL3-Basic組、miR-499a-5p+pGL3-Basic+TLR2組。將miR-NC、miR-499a-5p、anti-miR-NC、anti-miR-499a-5p、miR-499a-5p+pGL3-Basic、miR-499a-5p+pGL3-Basic+TLR2按照1∶3量加入脂質體試劑，混勻轉染至模型組心肌細胞H9c2，轉染5 h后，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，對各培養(yǎng)基采樣進行qRT-PCR，確認轉染是否成功。

1.3 qRT-PCR檢測細胞中miR-499a-5p、TLR2mRNA的表達[7]

收集各組細胞，用Trizol法提取細胞中RNA，采用逆轉錄試劑盒(北京莊盟國際生物基因科技有限公司)合成cDNA，反應體系5 μL(5×Prime Script RT Master MiX 2 μL，RNase-free ddH2O 3 μL)，輕柔混勻后進行加入DNA擴增儀中。反應條件為：37 ℃ 15 min反轉錄，85 ℃ 5 s反轉錄酶失活后，4 ℃保存。最后采用qRT-PCR試劑盒對cDNA中的miR-499a-5p、TLR2 mRNA進行熒光定量PCR，qRT-PCR反應體系20 μL，SYBR Premix Ex TaqⅡ (2×) 10 μL、PCR正反向引物(10 μM)各0.8 μL、 ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL、cDNA 2 μL、滅菌蒸餾水6 μL,進行PCR擴增。反應條件：95 ℃ 120 s，95 ℃ 45 s，60 ℃ 30 s，70 ℃ 45 s，共進行40次循環(huán)。最終在軟件中生成PCR循環(huán)曲線及循環(huán)閾值(Ct)，以GAPDH為內參，以2-△△Ct計算miR-499a-5p、TLR2 mRNA的表達量。見表1。

表1 引物序列

1.4 Western blot檢測細胞中TLR2、Bcl-xL、Bax、Caspase-3的蛋白表達

收集各組H9c2細胞，加入RIPA蛋白裂解使其充分裂解后，提取細胞中的總蛋白；將蛋白質置于在100 ℃沸水中變性10 min，取上清液進行蛋白電泳上樣；采用轉膜儀將上樣蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上，轉膜完成后用5%脫脂牛奶封閉處理2 h，而后在一抗 [包括兔抗TLR2(abcam，ab209216)、兔抗Bcl-xL(abcam，ab32370)、兔抗Bax(abcam，ab32503)、兔抗Caspase-3(abcam，ab32351)] 溶液中以4 ℃處理過夜；次日取膜洗凈后置于二抗溶液中，37 ℃孵育2 h；最后在凝膠儀中曝光得到蛋白條帶，根據(jù)蛋白條帶灰度值計算蛋白的相對表達量。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡

收集各組H9c2細胞，將細胞接種在6孔板內，嚴格按照V-FITC/P1凋亡試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司)說明書操作，取100 μL的細胞懸液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V-APC混勻后于室溫避光孵育5 min。加入10 μL的碘化丙啶(PI)20 μg/mL，并加400 μL磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，立刻進行流式檢測。流式細胞儀檢測時，Annexin V-APC用633 nm激發(fā)器激發(fā)，最大發(fā)射波長660 nm，建議使用FL4或RL1通道檢測。凋亡率(%)=早期凋亡(%)+晚期凋亡(%)

1.6 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測細胞中ROS、SOD、MDA含量

收集各組H9c2細胞，棄去培養(yǎng)液加入染色工作液于37 ℃孵育40 min，PBS緩沖液洗脫后，嚴格遵循試劑盒說明書操作步驟，完成一抗反應、二抗結合、底物制備及顯色，最后將樣本直接置于酶標儀中讀取吸光度(波長405～450 nm)并計算MDA(碧云天)、SOD(碧云天)和ROS(碧云天)含量。每個樣本做3個復孔，上述實驗重復3次取均值。

1.7 雙熒光素報告基因檢測[8]

通過使用Rnahybrid(https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid)生物信息學數(shù)據(jù)庫檢索miR-499a-5p靶向目的基因TLR2的結合位點。在H9c2細胞中構建雙熒光素酶基因報告分析。使用PCR擴增TLR2的野生型 (WT)3′-UTR序列，并將其克隆到pmirGLO載體中，采用點突變法擴增TLR2突變株 (MUT)3′-UTR序列，并克隆到pmirGLO載體中，建立熒光素酶報告質粒。再將已載入基因片段的pGL3-Basic與脂質體混合分別與miR-NC、miR-499a-5p、anti-miR-NC、anti-miR-499a-5p共同轉染至H9c2細胞。以每孔100 μL的量加入細胞懸液，緩慢搖15 min后，將細胞裂解液吸至1.5 mL離心管，4 ℃ 12 000 rpm離心10 min，取上清液，96孔板中加入Luciferase Assay ReagentⅡ (LARⅡ)工作液100 μL，加入20 μL細胞裂解液，測定記錄內參(firefly luciferase，F(xiàn)l)值。加入100 μL Stop&Glo Reagent，測定記錄Renilla luciferase (Rl)值，即為報告基因發(fā)光值。上述操作嚴格遵從雙熒光素酶報告基因測試試劑盒(碧云天)說明書。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 miR-499a-5p及TLR2在A/R模型H9c2細胞中的表達

與對照組相比，模型組TLR2蛋白的表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與miR-NC組相比，miR-499a-5p組TLR2蛋白表達降低，anti-miR-499a-5p組TLR2蛋白表達升高，anti-miR-499a-5p組TLR2蛋白表達水平高于miR-499a-5p組，上述差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

與對照組相比，模型組miR-499a-5p低表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與miR-NC組相比，miR-499a-5p組高表達，anti-miR-499a-5p組低表達，miR-499a-5p組與anti-miR-NC組相比呈高表達，上述差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.2 過表達miR-499a-5p對A/R模型H9c2細胞氧化應激及凋亡的影響

與miR-NC組相比，miR-499a-5p組細胞凋亡率下降，Bax、Caspase-3低表達，Bcl-xL高表達，ROS、MDA含量降低，SOD水平升高，上述差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3及圖4。

2.3 過表達TLR2對A/R模型H9c2細胞氧化應激及凋亡的影響

與miR-499a-5p+pGL3-Basic組相比，miR-499a-5p+pGL3-Basic+TLR2組細胞中細胞凋亡率上升，Bax、Caspase-3高表達，Bcl-xL低表達，ROS、MDA含量上升，SOD水平下降，上述差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖5及圖6。

2.4 miR-499a-5p靶向TLR2

與miR-499a-5p+pGL3-Basic組比較，miR-499a-5p+pGL3-Basic+TLR2組TLR2-WT細胞熒光活性降低(t=14.393，P<0.001)，TLR2蛋白呈低表達(t=16.042，P<0.001)；與anti-miR-499a-5p+pGL3-Basic組比較，anti-miR-499a-5p+pGL3-Basic+TLR2組TLR2-WT細胞熒光活性上升(t=6.227，P<0.001)，TLR2蛋白表達呈高表達(t=8.697，P<0.001)，可見，miR-499a-5p靶向作用于TLR2的表達。見表2。

表2 miR-499a-5p靶向

3 討論

本研究通過建立缺氧/復氧模型，觀察模型心肌細胞與正常心肌細胞時發(fā)現(xiàn)，模型細胞內miR-499a-5p呈低表達，TLR2蛋白高表達；在模型內各組比較中發(fā)現(xiàn)，與miR-NC組相比，miR-499a-5p組miR-499a-5p呈高表達，而anti-miR-499a-5p呈低表達，而TLR2的表達則與miR-499a-5p表達相反；在觀察過表達miR-499a-5p或過表達TLR2時發(fā)現(xiàn)，與氧化應激及細胞凋亡相關蛋白表達時呈現(xiàn)相反的趨勢。

國外一項臨床研究報告[9]顯示，發(fā)生不穩(wěn)定型心絞痛、非ST段抬高型心肌梗死患者發(fā)病后3 h內血清miR-499a-5p表達水平降低，提示miR-499a-5p可能與心肌細胞損傷有關，但其對心肌細胞的作用機制及靶基因研究尚不明確。Zhao等[10]通過制造缺氧/復氧模型研究指出，miR-499a-5p在心肌細胞中表達顯著降低，而過表達miR-499a-5p后心肌細胞的凋亡率下降；而另一相關研究[6]指出，miR-499a-5p通過抑制缺血再灌注模型中TLR2信號傳導，抑制如白細胞介素-6、白細胞介素-1β等促炎細胞因子的級聯(lián)反應，發(fā)揮對心肌細胞的保護作用。TLR2是近年來缺血再灌注損傷及心肌保護作用的新興治療靶點，此前的基礎研究[11-12]指出，通過抑制TLR2的激活，可明顯降低心肌梗塞面積及局部和全身炎癥細胞，而單核細胞中TLR2的表達水平或可作為心肌損傷程度的參考指標。雖然以往研究確立了miR-499a-5p對心肌細胞的作用及其可能與抑制TLR2表達相關，但對于缺氧/復氧心肌細胞的作用及miR-499a-5p與TLR2二者之間的靶向關系研究尚不明確。本研究通過觀察H9c2A/R模型細胞發(fā)現(xiàn)，與正常H9c2細胞相比，A/R模型細胞內miR-499a-5p低表達，TLR2卻呈高表達，這與上述研究基本一致。在通過進一步對比miR-499a-5p、miR-NC、anti-miR-499a-5p、anti-miR-NC中發(fā)現(xiàn)，在miR-499a-5p降低的組別中，TLR2均呈高表達，而在miR-499a-5p升高的組別中，TLR2均呈低表達，因此二者之間可能存在負調控關系。

在進一步研究H9c2細胞凋亡率時發(fā)現(xiàn)，miR-499a-5p過表達組凋亡率均低于對照組，而TLR2過表達組凋亡率均高于對照組。心肌細胞在缺氧條件下會發(fā)生線粒體功能障礙，線粒體內細胞色素C(Cyt-C)激活并被釋放入胞質，通過級聯(lián)反應激活Caspase-3蛋白并啟動線粒體凋亡程序[13-14]。Bcl-xL和Bax是一對負責調控線粒體膜上Cyt-C的蛋白分子，Bax蛋白可增加Cyt-C的釋放，促進凋亡作用，而Bcl-xL蛋白作用與其正好相反[15-16]。本研究通過對各模型組細胞進行Western blot檢驗，對比上述參與細胞凋亡的相關蛋白水平發(fā)現(xiàn)，與miR-NC組相比，miR-499a-5p組上調Bcl-xL蛋白表達，而Bax及Caspase-3蛋白均表達下調，而過表達TLR2的miR-499a-5p+pGL3-Basic+TLR2組下調Bcl-xL蛋白表達，而Bax及Caspase-3蛋白均表達上調。此外，在進行心肌細胞凋亡研究的同時，采用ELISA法檢測心肌細胞中ROS、SOD及MDA的水平，結果顯示，過表達miR-499a-5p的組別中ROS及MDA水平明顯降低，SOD水平升高，而過表達TLR2的組別中，ROS及MDA水平明顯上升，SOD水平降低，這結果與細胞凋亡率及其相關蛋白表達量波動情況相互吻合。另外，雙熒光素報告基因檢測結果顯示，miR-499a-5p與TLR2確實存在靶向關系。因此，miR-499a-5p一方面可能通過靶向下調TLR2的表達，抑制TLR2對免疫應答的作用，減少促炎細胞的累積及炎癥因子對心肌細胞的破壞，降低氧化應激反應程度，從而發(fā)揮保護心肌細胞的作用；另一方面，miR-499a-5p通過抑制Bax、Caspase-3蛋白的表達，上調Bcl-xL蛋白的表達，抑制心肌線粒體啟動凋亡程序，進而降低心肌細胞凋亡率，減輕損傷程度。

綜上，miR-499a-5p與TLR2為靶向關系，可能通過抑制局部和全身 TLR2 激活，降低心肌細胞凋亡率及氧化應激反應，發(fā)揮保護心肌細胞的作用。