細胞周期相關因子3在乳腺癌組織中的表達及對乳腺癌細胞增殖的影響

吳元肇，曾 勇，鄭克思，陳艷梅

(溫州市人民醫院 1.腫瘤外科；2.病理科，浙江 溫州 325000)

乳腺癌作為國內外常見的女性惡性腫瘤，是導致女性死亡的主要原因之一。根據2022年美國癌癥協會(ACS)統計，預計在2022年，中國發病率前5位的癌癥為肺癌、腸癌、胃癌、肝癌與乳腺癌。臨床常通過局部手術聯合化療、內分泌治療以及靶向藥物等綜合手段治療乳腺癌，患者往往能得到較好救治。然而，對于特殊類型三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)，臨床暫無有效內分泌治療方法及靶向策略。另外，臨床觀察發現，對于內分泌治療和靶向藥物有效的患者，在經過一線及二線治療后，常產生耐藥性，極大限制了其治療效果。因此，對乳腺癌的發生發展機制進行深入研究，對尋找新的治療靶點、開發新型治療方法具有極大臨床意義。

細胞周期相關因子3(cell division cycle associated protein 3,CDCA3)，作為F Box蛋白，是細胞有絲分裂過程中必需的胞質蛋白，對細胞周期、DNA復制等多種生物過程具有重要的調節作用。研究表明，CDCA3在多種惡性腫瘤發生發展過程中均呈高表達水平，抑制CDCA3蛋白表達，可降低腫瘤細胞活性，抑制腫瘤細胞增殖。然而，CDCA3在乳腺癌中的表達和功能研究較少。因此，本課題組收集臨床不同分期乳腺癌組織，利用生化實驗結合生物信息學方法分析CDCA3蛋白水平與乳腺癌預后的相關性；同時構建穩定敲低CDCA3基因的乳腺癌細胞株，進一步研究CDCA3在乳腺癌致病機制中的作用，以期為乳腺癌的靶向治療提供臨床實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 免疫組化檢測CDCA3在乳腺癌組織標本中的表達 收集我院2020年1月—10月乳腺癌標本庫中乳腺癌組織(不同組織型或者不同分期如早期中期晚期)41例，癌旁組織標本40例。本研究通過溫州市人民醫院倫理委員會審核并備案。采用免疫組化法檢測乳腺癌組織和癌旁組織中CDCA3的表達水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作(CDCA3抗體：Amresco)，試劑盒購自卡邁舒(上海)生物科技有限公司。倒置顯微鏡下，根據細胞染色的強弱直觀評分：-陰性(無染色)，+弱陽性(淡黃色)，++陽性(棕黃色)，+++強陽性(棕色)。

1.2 GEPIA平臺分析CDCA3在乳腺癌組織中的表達情況 通過GEPIA平臺(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析相對于正常乳腺組織，乳腺癌中CDCA3基因表達的差異，基因名稱選擇“CDCA3”，Dataset(Cancer name)選擇“BRCA”。

1.3 Kaplan-Meier Plotter數據平臺分析CDCA3與乳腺癌預后的關系 登錄Kaplan-Meier Plotter數據平臺(http://kmplot.com/analysis/)，檢索CDCA3基因，獲得CDCA3基因表達差異患者的生存曲線(對腫瘤病理類型及臨床分期、分級等不做限制)。

1.4 細胞株構建與CDCA3檢測 利用shRNA構建穩定干擾CDCA3表達的乳腺癌MCF7細胞株(Sh1，Sh2)及對照組細胞(NC)。培養MCF7乳腺癌細胞株(培養基：DMEM+10%FBS，細胞培養條件為5% CO，37 ℃)，DMEM購自美國Sigma公司，胎牛血清購自美國Gibco公司；胰酶和DMSO購自美國Amresco公司。通過慢病毒包裝系統構建穩定干擾CDCA3基因表達的乳腺癌細胞株(PLKO.1-CDCA3shRNA)及對照組細胞(漢恒生物，siRNA: Invitrogen，美國)。

取對數期細胞，PBS沖洗3遍，蛋白提取試劑盒提取總蛋白(Pierce，美國)，加入5×上樣緩沖液，100 ℃ 水浴鍋煮沸5 min后冷卻待用。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，移至PVDF膜，于脫脂牛奶中室溫封閉1 h，PBST洗膜10 min×3次，一抗稀釋液4 ℃ 孵育過夜，次日PBST洗膜10 min×3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗稀釋液室溫反應2 h，PBST洗膜10 min×3次，ECL顯影并分析條帶灰度。

1.5 細胞增殖檢測 分別收集對數生長期的穩定干擾CDCA3基因表達的MCF7細胞和對照組細胞，血球計數板計數后加入四塊96孔板中，5 000個細胞/孔，每個孔加入100 μL培養基，設置3復孔。待細胞貼壁后取出一塊96孔板，每孔中加入10 μL CCK8溶液作為起始對照樣本，37 ℃、5% CO細胞培養箱內繼續孵育0.5 h，于分光光度計450 nm波長處測定吸光值，保存數值。另三塊96孔板按藥物濃度依次加入含藥培養基，終體積100 μL，37 ℃、5% CO條件下分別培養24 h、48 h、72 h。取出加藥的96孔板，每孔加入10 μL CCK8溶液，37 ℃、5% CO細胞培養箱內繼續孵育0.5 h，450 nm測定吸光值，保存數值并分析。

1.6 乳腺癌細胞周期變化檢測 收集轉染48 h后的細胞，清洗離心后用固定液配置細胞懸液(1×10個/mL)，加入10 μL試劑B(70-APCC101，聯科生物，中國)，室溫避光孵育30 min。利用流式細胞儀(Becton-Dickinson，美國)、軟件FACS express version 3，分析細胞周期變化情況。

1.7 基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA) 通過GEO數據庫下載5套亞洲人乳腺癌基因芯片數據集(GSE6367、GSE9309、GSE15852、GSE33447和GSE45255)，共獲得318例乳腺癌和60例正常乳腺組織的基因表達譜數據。根據CDCA3基因表達水平高低分為兩組，利用GSEA(GSEA3.0版本)分析CDCA3的表達水平對各種生物通路基因集的影響。按默認加權富集統計方法，以從GSEA網站MsigDB數據庫中獲得的基因集作為參照基因集，置換次數為1 000次。

1.8 統計方法 采用Graghpad Prism 8.0軟件進行數據分析，計量資料組間比較應用Anova聯合檢驗。<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CDCA3在乳腺癌組織中的表達水平 本院標本的免疫組化分析結果顯示，乳腺癌組織中CDCA3蛋白表達量(1.83±0.72)顯著高于癌旁組織(1.02±0.51)，差異有統計學意義(<0.001)。GEPIA數據平臺中，共收集正常乳腺組織112例、乳腺癌組織1 085例，分析結果顯示，CDCA3在乳腺癌中的表達水平顯著高于正常乳腺組織，差異有顯著統計學意義(<0.05)，見圖1。

圖1 CDCA3在乳腺癌組織及癌旁組織(正常組織)中表達量的比較

2.2 CDCA3表達與乳腺癌患者預后的關系 Kaplan-Meier Plotter數據庫分析結果顯示，高表達CDCA3的乳腺癌患者50個月總體生存率(57.21%)低于CDCA3低表達者(70.22%)，差異具有統計學意義(<0.05)，見圖2。

圖2 CDCA3表達水平與乳腺癌患者預后的相關性

2.3 各組乳腺癌MCF7細胞增殖情況 Western blot檢測結果顯示，與對照組相比，Sh1組和Sh2組的CDCA3蛋白表達量明顯降低，可穩定敲低CDCA3表達(圖3A)。CCK8檢測結果顯示，與對照組相比，Sh1組和Sh2組在48 h和72 h的細胞增殖出現顯著抑制，差異具有統計學意義(<0.05)，見圖3B。

A.各組細胞中CDCA3蛋白表達量；B.各組細胞的增殖情況；與對照組(NC)比較，*P<0.05。

2.4 下調CDCA3后腫瘤細胞周期變化 流式細胞儀檢測結果顯示：與對照組(NC)細胞相比，敲低CDCA3后的MCF7細胞株(Sh1，Sh2)G1期顯著延長，差異具有統計學意義(< 0.05)，細胞周期的S、G2期差異無統計學意義(> 0.05)，見圖4。

與對照組(NC)比較，*P<0.05。

2.5 各組細胞NF-кB信號轉導通路相關蛋白表達情況 免疫印跡實驗結果顯示，下調CDCA3表達后，與對照組相比，Sh1組和Sh2組的NF-кB1(p50)、RelA(p65)蛋白表達減少，差異具有統計學意義(< 0.05)，見圖5。

A.各組細胞免疫印跡實驗結果；B.各組細胞NF-кB1(p50)蛋白表達；C.各組細胞RelA(p65)蛋白表達；與對照組(NC)比較，*P<0.05。

2.6 CDCA3高表達樣本的富集基因集 利用GSEA分析平臺對CDCA3高表達的乳腺癌細胞樣本富集基因進行分析，結果如表1所示：CDCA3高表達的乳腺癌細胞存在與NF-кB信號通路、E2F信號通路、mTOR信號通路、有絲分裂紡錘體、PI3K-AKT-mTOR信號通路、G1S 檢查點、糖酵解、未折疊蛋白反應、膽固醇平衡等相關的基因集。

表1 CDCA3高表達的乳腺癌樣本的GSEA

3 討論

乳腺癌被認為是危害女性健康的“頭號殺手”,并以每年3.1%的速度增長?，F有靶向治療方法(如HER-2抗體或內分泌治療)雖有較好的療效，但無法適用于所有乳腺癌患者，且常會不可避免地產生耐藥等問題。因此，探索乳腺癌發生發展高敏感性生物學指標，找尋新的生物治療靶點具有重大臨床意義。

已報道CDCA3是胃癌的潛在診斷標志物，可以促進胃癌細胞的生長。結直腸癌中，上調的CDCA3表達與結直腸癌的漿膜浸潤、TNM分期呈正相關。在非小細胞肺癌中，CDCA3能夠通過降解細胞周期抑制分子，進一步促進腫瘤細胞增殖，已被作為非小細胞肺癌的診斷標志物和治療靶點。已有實驗證實，前列腺癌中Homeobox B3可通過綁定到CDCA3啟動子區，活化CDCA3蛋白，促進前列腺癌的發展進程。然而，乳腺癌中CDCA3的具體機制仍未完全清晰。

本研究結果顯示，在收集的乳腺癌患者樣本中，乳腺癌組織CDCA3的表達量顯著高于癌旁組織，TCGA數據庫分析亦顯示CDCA3基因在乳腺癌中的表達水平顯著高于正常乳腺組織。同時，通過Kaplan-Meier Plotter數據庫分析顯示，CDCA3表達與乳腺癌患者的預后呈負相關，提示CDCA3低表達的患者具有更好的生存時間和預后轉歸。進一步利用慢病毒包裝系統，成功構建穩定敲低CDCA3的乳腺癌細胞株，CCK8細胞增殖檢測結果顯示CDCA3基因干擾能夠顯著抑制乳腺癌細胞MCF7的增殖活性，提示CDCA3在乳腺癌的發生發展中發揮重要作用。

CDCA3為細胞周期分裂相關蛋白家族成員，是S期激酶相關蛋白1(SKP1)/淘汰素(Cullin1)/F-box(SCF)E3泛素連接酶復合物的一部分，可通過調節有絲分裂抑制激酶weel的降解過程，介導細胞周期的進展，被稱為進入有絲分裂的“觸發因子”。前期研究報道證實，結腸癌細胞SW480中敲減CDCA3后，在體內和體外均可觀察到細胞增殖出現顯著抑制，其可能機制為細胞周期G1到S期的轉換停滯。而本實驗中我們同樣觀察到，CDCA3下調后細胞周期的G1期顯著延長，且可能與調節增殖相關NF-кB通路蛋白相關。另一方面，GSEA分析結果顯示，CDCA3亦可能通過多種與細胞周期相關的生物學過程(如G1S檢查點、未折疊蛋白反應、有絲分裂紡錘體等)、多種與腫瘤增殖相關的信號通路(E2F信號通路、NF-кB信號通路、mTORC1以及PI3K-AKT-mTOR信號通路)以及多種代謝相關的生物學過程(糖酵解和脂肪平衡)調節乳腺細胞增殖，促進癌細胞生長。

綜上所述，CDCA3在乳腺癌組織中表達顯著增加，且CDCA3的表達水平與乳腺癌患者的預后呈顯著負相關，在乳腺癌細胞中干擾CDCA3表達可顯著抑制乳腺癌細胞增殖。同時，結合生物信息學分析提示CDCA3可能是乳腺癌進展的關鍵分子，是預防和治療乳腺癌的潛在生物標志物和治療靶點。但是，本研究尚未對CDCA3促進乳腺癌的發生發展的機制進行研究，將在今后研究中進一步探索。