mNGS 應(yīng)用于肺部感染患者病原學(xué)檢測中的研究進(jìn)展

周茂旗 李興明 王憲剛 陳皓楠 張 永

1.成都醫(yī)學(xué)院，四川成都 610500；2.四川省內(nèi)江市第一人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，四川內(nèi)江 641000

宏基因二代測序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）是臨床上一種新興的病原檢測方式，其采用的是半導(dǎo)體芯片測序技術(shù)，將堿基對合成核酸鏈的過程轉(zhuǎn)化為數(shù)字信息，將待測的DNA鏈固定在半導(dǎo)體芯片微孔中的微球上，隨后依次摻入ACGT 堿基，符合配對的堿基與待測DNA 鏈形成化學(xué)鍵，釋放出氫離子，通過檢測H信號(hào)的變化獲得序列堿基信息，將生成序列堿基信息連接到精確的參考基因組數(shù)據(jù)庫，以識(shí)別檢出病原體。

PDC-seq病原微生物宏基因組檢測是通過對生物樣本中提取的核酸進(jìn)行高通量測序，利用生物信息學(xué)進(jìn)行比對分析，獲取樣本中包含的微生物種類和豐度信息，檢測全面覆蓋16000 多種病原體，包括細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲等。基于 Illumina 測序平臺(tái)和 PCR-free 建庫技術(shù)，可避免聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引入的擴(kuò)增偏向性和氣溶膠污染，同時(shí)優(yōu)化核酸提取，解決真菌和分支桿菌破壁難、檢出率低等問題，在疑難危重感染病例中有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 mNGS發(fā)展史

臨床應(yīng)用的元基因組學(xué)起源于2000 年初的微陣列，微陣列是一組微觀特征（最常見的是DNA），用目標(biāo)分子進(jìn)行探測，以產(chǎn)生定量（基因表達(dá)）或定性（診斷）數(shù)據(jù)。隨著微陣列技術(shù)在效率、識(shí)別力、敏感度和特異性方面的不斷提高，已被應(yīng)用于各種病原微生物的檢測、鑒定、新病原體的發(fā)現(xiàn)、抗菌素耐藥性監(jiān)測和菌株分型，而后有學(xué)者在Affymetrix基因芯片平臺(tái)上開發(fā)了重測序微陣列，應(yīng)用于呼吸道病原體檢測，可以同時(shí)檢測和區(qū)分大量微生物病原體。直至2005 年二代測序技術(shù)的出現(xiàn)正式啟動(dòng)了元基因組學(xué)領(lǐng)域，此后，隨著臨床病原微生物檢測的需求越來越大，mNGS 技術(shù)逐漸從實(shí)驗(yàn)室步入臨床實(shí)踐應(yīng)用中。近年來mNGS 技術(shù)已成功應(yīng)用于臨床診斷新發(fā)病原體感染，如2013 年Wilson 等應(yīng)用mNGS 技術(shù)在1 例不明原因發(fā)熱、頭痛的聯(lián)合免疫缺陷男孩的腦脊液中首次檢測出了神經(jīng)型鉤端螺旋體感染；2014 年Knittler 等研究者應(yīng)用mNGS技術(shù)診斷了1 例由鸚鵡螺桿菌（傳統(tǒng)常規(guī)微生物檢測難以識(shí)別）引起的嚴(yán)重肺炎和多器官衰竭病例；2021 年四川省人民醫(yī)院黃曉波團(tuán)隊(duì)用mNGS 診斷了1 例在感染早期迅速發(fā)展為嚴(yán)重急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的患者，接受了體外膜氧合（extracorporeal membrane oxygenation，ECMO）治療后，并發(fā)軍團(tuán)菌感染繼發(fā)曲霉菌感染的病原體，目前為止，mNGS 技術(shù)在臨床上的應(yīng)用越來越廣泛。

2 mNGS在病原學(xué)檢測中的優(yōu)勢

肺部感染是一個(gè)全球性的健康問題，與高發(fā)病率、高死亡率以及不斷增加的住院率相關(guān)。目前對于肺部感染的治療多以經(jīng)驗(yàn)性抗菌治療為主，然而由于經(jīng)驗(yàn)性治存在抗菌藥物濫用、藥物不良反應(yīng)以及未能覆蓋所有病原菌等風(fēng)險(xiǎn)，治療不當(dāng)易導(dǎo)致病情惡化，增加患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)。由于不能快速診斷和區(qū)分呼吸道感染的病原體，抗生素的過度使用仍然是一個(gè)長期問題，因此快速準(zhǔn)確識(shí)別病原體是合理治療肺部感染的必要條件。我國肺炎患者并未常規(guī)進(jìn)行呼吸道病毒篩查，在某些病毒感染病例中，mNGS 技術(shù)明確了其診斷，并進(jìn)行了有效診治。對于肺部感染患者，早期實(shí)施針對性的治療，對提高患者生存率、改善患者預(yù)后尤為重要。臨床上傳統(tǒng)病原學(xué)微生物檢測方法包括痰涂片及培養(yǎng)、血培養(yǎng)、PCR、抗原抗體檢測等，痰培養(yǎng)是目前臨床最常用的檢測手段，然而痰培養(yǎng)存在陽性率低、培養(yǎng)周期長、部分病原體培養(yǎng)困難等局限，因此痰培養(yǎng)不能快速提供準(zhǔn)確的病原體報(bào)告來指導(dǎo)臨床科學(xué)合理的用藥。mNGS 技術(shù)在病原微生物檢測方面，以高效、快速、準(zhǔn)確著稱，其能快速提供呼吸道所有病原微生物檢測報(bào)告，覆蓋數(shù)據(jù)庫中絕大部分病原微生物，尤其是對罕見和新生的微生物的檢測 有著較高的效能，能很大程度上彌補(bǔ)傳統(tǒng)檢測的 不足。

2.1 mNGS 病原檢測陽性率

mNGS 技術(shù)在肺部感染患者病原體檢測的陽性檢出率方面顯著高于傳統(tǒng)病原學(xué)檢測方法。Wu 等進(jìn)行的一項(xiàng)前瞻性研究中，納入329 例成人重癥社區(qū)獲得性肺炎患者，完善支氣管鏡檢測，獲取等量肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）同時(shí)進(jìn)行mNGS 檢測和傳統(tǒng)方法檢測病原體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)mNGS 檢測組中304 例（99.24%）確定了病原體，mNGS 的總微生物檢出率為90.3%，而傳統(tǒng)檢測方法病原檢出率為39.5%（＜0.05）。另外Shi 等對110 例疑似肺結(jié)核患者的BALF 標(biāo)本進(jìn)行mNGS檢測，并與BALF 或痰標(biāo)本的常規(guī)微生物檢測進(jìn)行比較，結(jié)果mNGS 的敏感度（67.23%）明顯高于培養(yǎng)（36.36%）、結(jié)核分枝桿菌PCR 檢測（45.83%）、抗酸桿菌染色法（29.17%）；有研究發(fā)現(xiàn)，mNGS 測試的敏感度和特異性分別為79.2%（95.0%73.5%～85.2%）和90.6%（95%：87.3%～93.8%），這些研究結(jié)果充分證實(shí)了mNGS 技術(shù)在病原體檢測陽性率方面較傳統(tǒng)檢測法的顯著優(yōu)勢。

2.2 mNGS 病原體檢測準(zhǔn)確性

mNGS 技術(shù)應(yīng)用于肺部感染患者能檢測出標(biāo)本中所有的病原微生物，相比傳統(tǒng)檢測方法檢測范圍更加廣泛，對臨床的診斷也更加準(zhǔn)確、全面。有研究發(fā)現(xiàn)，mNGS 技術(shù)與結(jié)核分枝桿菌PCR 檢測（Xpert）和培養(yǎng)法對結(jié)核分枝桿菌的檢測結(jié)果的一致性較高，Kappa一致性分析的Kappa值分別為0.702（Xpert 法）和0.809（培養(yǎng)法）；mNGS 技術(shù)、Xpert法和培養(yǎng)法的特異性分別為 98.39%、98.39%和100%。Zhou 等進(jìn)行了一項(xiàng)mNGS 技術(shù)檢測肺炎患者BALF 病原體對肺炎的診斷和治療的臨床意義的多中心前瞻性觀察研究，結(jié)果表明mNGS 檢測結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)檢測結(jié)果完全一致的有85 例（一致性為53.5%），64 例患者根據(jù)mNGS 結(jié)果調(diào)整了治療方案（64 例積極影響病例）且明確診斷。總之，mNGS技術(shù)進(jìn)行病原體檢測的準(zhǔn)確性方面較傳統(tǒng)檢測方法更高。

2.3 mNGS 病原體檢測時(shí)效性

mNGS 技術(shù)應(yīng)用于肺部感染患者病原體檢測方面，相比傳統(tǒng)檢測方法耗時(shí)較少，能快速提供病原體報(bào)告，普通細(xì)菌培養(yǎng)一般需要48～72h，結(jié)核桿菌的培養(yǎng)至少需要4 周，支原體培養(yǎng)至少需要6 周。有研究顯示，mNGS 在3d 內(nèi)鑒定了119 例感染病例中的80 例（67.23%）病原微生物，這是外送檢測的情況下。若在醫(yī)院應(yīng)用測序平臺(tái)，檢測時(shí)間將可能縮短到24h；而常規(guī)方法90d 的檢出率為49.58%（59/119）；常規(guī)檢測方法的平均反饋時(shí)間從1d 到60d 不等，Xpert 需要1d 左右，抗酸桿菌染色至少需要3d，真菌血清學(xué)試驗(yàn)通常需要5～7d，病原體培養(yǎng)平均反饋時(shí)間中細(xì)菌≥3d，真菌≥7d，分枝桿菌為42～60d。臨床上大多數(shù)mNGS 檢測報(bào)告時(shí)間為1～2d，甚至更快，充分證明了mNGS 技術(shù)在檢測肺部感染患者病原體方面較傳統(tǒng)檢測方法耗時(shí)更少、更加快速。

3 mNGS病原學(xué)檢測中的局限性

3.1 假陽性

mNGS 檢測的多數(shù)讀數(shù)（＞99%）來自人類宿主，因此限制了病原體檢測的總靈敏度。宿主耗竭方法的使用與靶向測序不同，宿主耗竭方法旨在降低mNGS 讀數(shù)中人類宿主背景序列的相對比例，而不是利用已知的病原體序列作為靶標(biāo)，這種方法保留了宏基因組測序無偏見的優(yōu)點(diǎn)，能檢測出樣本中所有的微生物，但不能分辨致病與否、污染與否，在樣本采集過程中、檢測樣品、用于加工的試劑或?qū)嶒?yàn)室環(huán)境中均存在微生物的污染，因此檢測結(jié)果存在假陽性可能，假陽性mNGS 結(jié)果可能會(huì)導(dǎo)致診斷錯(cuò)誤和治療無效。Zhou 等的研究中，mNGS 檢測出1 例奇異變形桿菌感染，但該標(biāo)準(zhǔn)檢測結(jié)果均為陰性，該患者接受了奇異變形桿菌肺炎的針對性治療后療效不佳，最終該病例被診斷為隱源性機(jī)化性肺炎，其是一種罕見的間質(zhì)性肺部疾病，研究結(jié)果說明在臨床上不能完全依靠mNGS 檢測結(jié)果來作出診斷與治療，還應(yīng)參考患者其他輔助檢查，結(jié)合患者臨床表現(xiàn)與體征進(jìn)行診治。

3.2 mNGS 檢測結(jié)果解釋沒有明確標(biāo)準(zhǔn)

目前許多檢測公司對mNGS 檢測結(jié)果的解釋，并沒有一個(gè)明確的標(biāo)準(zhǔn)。即使大家基本參照的是微生物基因數(shù)據(jù)庫，然而不同機(jī)構(gòu)的數(shù)據(jù)分析人員可能存在主觀偏倚；微生物參考數(shù)據(jù)庫也存在一些局限：①稀有病原體或新出現(xiàn)的不可知的病原體菌株的參考數(shù)據(jù)庫不完整。②參考數(shù)據(jù)庫偏向于某些臨床常規(guī)的微生物。③某些重要的病原體核酸序列可能在遺傳上相似（如分枝桿菌的種類）而難以區(qū)分。④受到正常定植微生物和引入試劑的核酸序列影響，使讀數(shù)混；不同平臺(tái)在處理數(shù)據(jù)時(shí)存在差異，在檢測過程中的質(zhì)量控制亦各有千秋。目前臨床上尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)流程，因此，不同平臺(tái)的檢測結(jié)果可能存在些許差異，臨床醫(yī)生在面對該檢測報(bào)告時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎思考，給予正確的診治。

4 展望

mNGS 技術(shù)應(yīng)用于肺部感染性疾病的病原體檢測方面既有優(yōu)勢同時(shí)也存在局限。目前國內(nèi)大部分醫(yī)院尚未在院內(nèi)開展mNGS 檢測實(shí)驗(yàn)室，患者需檢測mNGS，則需將樣本外送基因公司或各大檢測平臺(tái)進(jìn)行檢測，這不僅加大了該項(xiàng)檢測的經(jīng)濟(jì)成本，也增加了樣本污染的機(jī)會(huì)，限制了該項(xiàng)技術(shù)的推廣。然而即使存在局限，在臨床上也應(yīng)權(quán)衡利弊后做出科學(xué)合理的抉擇，以免貽誤患者病情。總之，mNGS技術(shù)在檢測感染性疾病病原微生物方面的影響是積極的，總體發(fā)展趨勢是向上的，相信在未來的不斷發(fā)展中，mNGS 技術(shù)能造福于越來越多的患者，為醫(yī)學(xué)發(fā)展做出顯著貢獻(xiàn)。