藤龍補中湯對大腸癌荷瘤小鼠免疫功能的影響※

黃曉偉 王雙雙 鄭佳露 陳 雷 彭 驍 陳錦芳 安紅梅 胡 兵△

(1．上海中醫藥大學附屬龍華醫院中醫腫瘤研究所，上海 200032；2.上海中醫藥大學基礎醫學院，上海 201203；3.上海中醫藥大學附屬龍華醫院腫瘤科，上海 200032； 4.上海中醫藥大學附屬龍華醫院科技處，上海 200032)

中醫藥在大腸癌的治療中發揮了重要作用，根據大腸癌的臨床表現，將其歸為中醫學積聚、臟毒、腸覃等范疇。我們在臨床實踐基礎上，以解毒、利濕、健脾立法，研發了治療大腸癌的抗癌中藥復方藤龍補中湯(專利號：ZL200910197565)，現代藥理研究證實，藤龍補中湯可調控多基因表達，抑制大腸癌生長和轉移，并改善患者免疫功能[1-7]。我們通過動物實驗觀察藤龍補中湯提取物對大腸癌荷瘤小鼠免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性BALB/c小鼠30只，6周齡，體質量(18±2)g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，許可證號：SCXK(滬)2017-0005。飼養于復旦大學實驗動物中心SPF級動物房(倫理號：202112025Z)，所有小鼠自由飲水。

1.2 主要試劑 小鼠大腸癌CT26細胞(中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心)；RPMI1640培養基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(美國Gibco公司)；復方斑蝥膠囊(貴州益佰制藥股份有限公司，國藥準字Z52020238)；無菌水溶解藤龍補中湯提取物(上海中醫藥大學藥學院制備[8])；干擾素γ(IFN-γ)、白細胞介素12(IL-12)酶聯免疫吸附法(ELISA)試劑盒(英國Abcam公司)；小鼠CD3、CD4、CD8、自然殺傷(NK)細胞1.1及其同型抗體(美國BD生物科學公司)；紅細胞裂解液(碧云天生物技術有限公司)；磷酸緩沖液(瑞典Medicago公司)。

1.3 皮下移植瘤模型制備及干預 所有小鼠飼養1周后進行CT26細胞皮下注射。CT26細胞常規培養，胰酶消化、計數，用磷酸緩沖液調整細胞濃度至1×107個/mL，取細胞懸液，無菌操作于每只小鼠皮下注射細胞懸液0.1 mL，待腫瘤生長至可測量范圍時，即為造模成功。按照隨機數字表法分為對照組、復方斑蝥膠囊組和藤龍補中湯組，每組10只，分別予無菌水、復方斑蝥膠囊195 mg/kg和無菌水溶解藤龍補中湯提取物2.56 g/kg灌胃，每次0.2 mL，每日1次，共15 d。均予飼料，自由飲用無菌水，灌胃結束后取血、處死小鼠，稱量脾、胸腺質量，按公式計算臟器指數。臟器指數=臟器質量(mg)/體質量(g)×10。

1.4 免疫細胞檢測 小鼠處死前，每組取3只小鼠，通過眼眶取血，取150 μL抗凝血至離心管中，加入2%牛血清白蛋白溶液10 μL，混勻，室溫封閉10 min，同型對照組加入CD3、CD4、CD8同型抗體20 μL或NK1.1同型抗體2 μL，待測樣品加入CD3、CD4、CD8抗體20 μL或NK細胞1.1抗體2 μL，室溫孵育20 min，加入紅細胞裂解液1.2 mL，室溫避光裂解2 min，至澄清透明，將上樣管以1600 r/min離心6 min，棄上清液，然后再加入磷酸緩沖液2 mL，輕微震蕩混勻，離心6 min，棄上清，重復洗2次，加入0.9%氯化鈉注射300 μL中，重懸細胞，流式細胞儀(DxFLEX型，Beckman)上機檢測CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞和NK細胞。

1.5 細胞因子檢測 小鼠處死前，每組取4只，小鼠取100 μL血清加入冰浴上的酶標包被板孔里，4 ℃輕搖過夜，倒出液體，1 × 洗滌液洗滌4次，加1×檢測抗體100 μL，室溫輕搖1 h，倒出液體，1 × 洗滌液洗滌4次，加1 × 辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素100 μL,室溫輕搖45 min，倒出液體，1 × 洗滌液洗滌4次，加底物100 μL，室溫避光孵育30 min，加終止液50 μL，酶標儀(Synergy HTX型，BioTek)450 nm檢測輔助型T淋巴細胞1(Th1)型細胞因子IFN-γ、IL-12光密度，結果以對照組倍數表示。

2 結果

2.1 3組脾指數、胸腺指數比較 復方斑蝥膠囊組、藤龍補中湯組脾指數、胸腺指數均高于對照組(P<0.05)；藤龍補中湯組胸腺指數高于復方斑蝥膠囊組(P<0.05)；復方斑蝥膠囊組與藤龍補中湯組脾指數比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組脾指數、胸腺指數比較

2.2 3組免疫細胞比較 復方斑蝥膠囊組、藤龍補中湯組CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞、NK細胞均高于對照組(P<0.05)；藤龍補中湯組CD4+T淋巴細胞低于復方斑蝥膠囊組(P<0.05)，藤龍補中湯組CD8+T淋巴細胞、NK細胞均高于復方斑蝥膠囊組(P<0.05)；復方斑蝥膠囊組與藤龍補中湯組CD3+T淋巴細胞比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組免疫細胞比較

2.3 3組Th1型細胞因子比較 復方斑蝥膠囊組、藤龍補中湯組IFN-γ、IL-12均高于對照組(P<0.05)；藤龍補中湯組IFN-γ、IL-12均高于復方斑蝥膠囊組(P<0.05)。見表3。

表3 3組Th1型細胞因子比較

3 討論

藤龍補中湯由藤梨根、龍葵、蛇莓、白術、茯苓、薏苡仁、半枝蓮、槲寄生組成，其中藤梨根、龍葵解毒利濕，蛇莓解毒抗癌，白術、茯苓、薏苡仁健脾利濕，半枝蓮、槲寄生協同抗癌，全方共奏解毒、利濕、健脾功效。前期研究顯示，藤龍補中湯可抑制大腸癌腫瘤生長和轉移，誘導細胞衰老和凋亡，調節免疫功能[1-3]。現代藥理研究表明，龍葵多糖可提高荷瘤小鼠胸腺指數，升高IFN-γ，增加T淋巴細胞、NK細胞和巨噬細胞在腫瘤組織的浸潤[9-10]。白術多糖可激活T淋巴細胞[11]，升高CD4+和CD8+T淋巴細胞[12]。茯苓可升高IL-2和IFN-γ，調節免疫功能[13-14]。薏苡仁可升高IFN-γ、IL-2，提高CD4+T淋巴細胞，改善細胞免疫功能[15-16]。

參與抗腫瘤免疫的T淋巴細胞主要包括CD4+和CD8+。CD4+由胸腺來源Th0 細胞在IL-12的作用下分化為Th1細胞，進而分泌IL-2、IFN-γ等細胞因子，激活CD8+細胞毒T細胞(CTL)執行抗腫瘤免疫；也可在IL-4作用下分化為Th2細胞，分泌IL-4、IL-5等細胞因子，參與體液免疫調控[17]。NK細胞是抗腫瘤固有免疫的主要細胞群體，可非特異殺傷腫瘤細胞，是腫瘤免疫治療的重要細胞[18-19]。

本研究結果顯示，藤龍補中湯可升高大腸癌荷瘤小鼠脾指數、胸腺指數，提高外周血CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細胞和NK細胞，同時升高IL-12、IFN-γ水平，提示藤龍補中湯可改善大腸癌荷瘤小鼠免疫功能，激發Th1型免疫反應。