mTOR和JNK通路調節神經病理性大鼠杏仁核MCP-1表達的作用分析*

李耿章，符文紅，楊馮睿

(1.邵陽學院附屬第一醫院麻醉科，湖南邵陽 422001；2.南華大學附屬第一醫院麻醉科，湖南衡陽 421001)

神經病理性疼痛(NP)是臨床難治性疾病，杏仁核活動與疼痛行為密切相關[1-2]，抑制杏仁核活動可緩解NP[3]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其在調控長時程突觸可塑性上發揮重要作用[4]。mTOR及其下游效應物被發現表達于疼痛處理主要區域的脊髓背根神經節(DRG)和脊髓背角，有助于傷害性信息的傳遞和調制。研究發現，c-Jun氨基末端激酶(JNK)是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成員之一，可在神經損傷后的脊髓星形膠質細胞中持續活化，而JNK抑制劑SP600125可改善脊髓損傷后的NP癥狀[5-6]。本課題組前期研究發現，單核細胞趨化因子-1(MCP-1)參與NP狀態下杏仁核功能異常，然而，NP狀態下杏仁核中mTOR和JNK表達的變化及其與MCP-1關系尚不清楚，故本研究將進行初步探討，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑

兔抗MCP-1單克隆抗體(批號：sc-4906，美國Santa Cruz公司)，磷酸化mTOR(p-mTOR)多克隆抗體(批號：ab45989，美國Abcam公司)，磷酸化JNK (p-JNK) 單克隆抗體(批號：ab124954， 美國Abcam公司)，mTOR抑制劑雷帕霉素(批號：HY-10219，美國MCE公司)，JNK抑制劑SP600125(批號：420119-5MG，德國Merck公司)，MCP-1 ELISA試劑盒(美國RD公司)。

1.1.2實驗動物與分組

選取2月齡200～260 g雄性SD大鼠96只，采用左側第5/6腰椎(L5/6)脊神經結扎(SNL)制備NP模型。實驗分為3個部分：(1)將24只大鼠于SNL術前及術后第7、14和21天(d0、d7、d14和d21，各6只)取杏仁核，采用Western blot檢測p-mTOR、p-JNK表達情況并分析二者與MCP-1水平的相關性；(2)48只NP模型大鼠雙側杏仁核注射不同濃度mTOR抑制劑雷帕霉素(0、0.1、1.0和10.0 μmol/L)或JNK抑制劑SP600125(0、0.1、1.0和10.0 μmol/L)，于術后21 d(每個濃度各6只)取杏仁核，采用ELISA檢測MCP-1水平，免疫組織化學法檢測MCP-1陽性細胞數；(3)24只大鼠分為3組，即假手術組(僅暴露脊神經而不結扎)、模型組及抑制劑組(雙側杏仁核注射10 μmol/L SP600125或雷帕霉素3 μL)，于d0、d4、d7、d14、d21共5個時間點測定各組機械痛閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)。本實驗所用大鼠購自上海斯萊克公司，飼養于無特殊病原體(SPF)級實驗動物中心，明暗時間設定為12 h∶12 h，保持室溫20～22 ℃，濕度60%～70%。

1.2 方法

1.2.1NP模型制備

采用左側L5/6 SNL制備NP模型，簡述如下：經50 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，俯臥位固定在顯微外科裝置下，取后正中切口暴露第4腰椎(L4)至第3骶椎(S3)的棘突和椎板，小心地移除左側L6橫突，分離左側L5和L6脊神經并結扎，隨后采用6-0絲線連續縫合肌肉和皮膚切口。假手術組大鼠僅暴露L5和L6脊神經，但不結扎。所有大鼠均給予連續5 d青霉素腹腔注射(20萬U/d)。剔除術后出現神經功能缺損的大鼠。

1.2.2杏仁核p-mTOR、p-JNK水平檢測

分別于d0、d7、d14、d21將大鼠過量麻醉致死，斷頭取腦，液氮速凍，迅速取出杏仁核，研磨至勻漿，蛋白裂解液提取細胞中的總蛋白，然后采用Western blot檢測提取的蛋白水平。具體操作如下：每組提取等量蛋白(添加適量的上樣緩沖液)，水浴鍋加熱使蛋白變性，將處理好的蛋白樣品(每個膠孔上樣量為20 μL左右)進行常規十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，采用濕轉法將凝膠上的蛋白轉移至聚偏氟乙烯((PVDF)膜。將膜放置于5%脫脂奶粉中封閉2 h，之后用配制好的p-mTOR、p-JNK一抗(稀釋比為1︰1 000)在4 ℃冰箱中孵育過夜。第2天加入二抗室溫孵育1 h，用TBST洗滌3次后加入電化學發光(ECL)顯色液顯色，并使用凝膠成像設備進行結果觀察和拍照存檔。

1.2.3杏仁核MCP-1水平檢測

于術后21 d取制備好的杏仁核勻漿液，采用ELISA試劑盒檢測MCP-1水平。操作步驟嚴格遵循試劑盒說明書，在450 nm波長下采用ELx800型酶標儀檢測吸光度(A450)值。

1.2.4杏仁核MCP-1陽性細胞數檢測

于d21將大鼠過量麻醉致死，經升主動脈灌注4%多聚甲醛500 mL，迅速取出杏仁核，經包埋劑處理后，以20 μm厚度行橫向冰凍切片，直接轉移至預冷的顯微鏡載玻片，經煮沸的檸檬酸緩沖液抗原修復和3%過氧化氫消除內源性過氧化物酶活性后，采用稀釋比例為1∶200的MCP-1過夜孵育。經相應二抗處理后用二氨基聯苯胺(DAB)顯色，再經過蘇木素復染，鏡下觀察陽性細胞數目。

1.2.5MWT測定

分別于d0、d4、d7、d14、d21測定各組大鼠的MWT。所有的行為測試均在9：00—14:00進行。MWT參照文獻[7]采用序貫法進行測定。將大鼠置于透明的塑料盒中適應至少30 min，采用0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和15.0 g的von Frey纖維絲，初始刺激為2.0 g，垂直刺激左后足跖面，以細絲稍彎曲作為完全受力的標準，每次持續6 s。當出現左后爪急劇縮回或細絲移開立即退縮為陽性反應，依次增加和減少刺激強度，直至出現第1次陽性和陰性(或陰性和陽性)反應的騎跨，再向下連續測定4次。不同刺激之間相隔30 s，以消除前一刺激的影響。最后計算誘發50%大鼠縮足反應的刺激強度即MWT。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 SNL后不同時間點p-mTOR水平

Western blot檢測結果顯示，與d0相比，d7、d14、d21NP模型大鼠杏仁核中p-mTOR水平升高(P<0.05)，且d21水平最高；進一步分析發現，d21的大鼠杏仁核p-mTOR水平與MCP-1水平呈正相關(r=0.629，P<0.05)，見圖1。

2.2 SNL后不同時間點p-JNK水平

Western blot檢測結果顯示，與d0相比，d7、d14、d21NP模型大鼠杏仁核中p-JNK水平升高(P<0.05)，且d21水平最高；進一步分析發現，d21的大鼠杏仁核p-JNK水平與MCP-1水平呈正相關(r=0.564，P<0.05)，見圖2。

2.3 杏仁核注射SP600125對MCP-1表達的影響

與0 μmol/L組相比，0.1、1.0、10.0 μmol/L組大鼠杏仁核MCP-1水平及陽性細胞數均降低，差異有統計學意義(P<0.05)，且10.0 μmol/L組大鼠杏仁核MCP-1水平及陽性細胞數最低，見圖3、4。

2.4 杏仁核注射雷帕霉素對MCP-1表達的影響

與0 μmol/L組相比，0.1、1.0、10.0 μmol/L組大鼠杏仁核MCP-1水平及陽性細胞數均降低，差異有統計學意義(P<0.05)，且10 μmol/L組大鼠杏仁核MCP-1水平及陽性細胞數最低，見圖5、6。

A：p-mTOR相對表達水平柱狀圖；B：p-mTOR水平與MCP-1水平的相關性分析；C：p-mTOR與MCP-1的蛋白電泳條帶；a:P<0.05,與d0比較。

A：p-JNK相對表達水平柱狀圖；B：p-JNK水平與MCP-1水平的相關性分析；C：p-JNK與MCP-1的蛋白電泳條帶；a:P<0.05,與d0比較。

A：0 μmol/L組；B：0.1 μmol/L組；C：1.0 μmol/L組；D：10.0 μmol/L組。

A：MCP-1水平柱狀圖；B：MCP-1陽性細胞數柱狀圖；a:P<0.05，與0 μmol/L比較。

2.5 杏仁核注射SP600125對MWT的影響

假手術組、模型組和SP600125組大鼠d0MWT比較，差異無統計學意義(P>0.05)；假手術組大鼠d0、d4、d7、d14、d21MWT比較，差異無統計學意義(P>0.05)；與d0相比，模型組和SP600125組d4、d7、d14、d21的MWT均降低(P<0.05)。模型組d4、d7、d14、d21的MWT均明顯低于假手術組(P<0.05)；經SP600125治療后大鼠降低的MWT獲改善，SP600125組d7、d14、d21的MWT均高于模型組(P<0.05)，但仍低于假手術組(P<0.05)，見圖7。

A：0 μmol/L組；B：0.1 μmol/L組；C：1.0 μmol/L組；D：10.0 μmol/L組。

2.6 杏仁核注射雷帕霉素對MWT的影響

假手術組、模型組和雷帕霉素組大鼠d0MWT比較，差異無統計學意義(P>0.05)；假手術組大鼠d0、d4、d7、d14、d21MWT比較，差異無統計學意義(P>0.05)；與d0相比，模型組和雷帕霉素組d4、d7、d14、d21的MWT均降低(P<0.05)。模型組d4、d7、d14、d21的MWT均明顯低于假手術組(P<0.05)；經雷帕霉素治療后大鼠降低的MWT獲改善，雷帕霉素組d7、d14、d21的MWT均高于模型組(P<0.05)，但仍低于假手術組(P<0.05)，見圖8。

3 討 論

越來越多的證據表明，趨化因子MCP-1通過促進趨化因子受體2(CCR2)活化在慢性疼痛中發揮關鍵作用。MCP-1在DRG初級感覺神經元中表達，且神經損傷后表達增加[8]。到目前為止，針對產生痛覺過敏已經提出兩種不同的機制：(1)MCP-1從一部分感覺神經元的中釋放出來，刺激周圍感覺神經元[9]，在DRG中導致這些神經元過度活躍。(2)MCP-1在DRG神經元中央末端釋放，誘導小膠質細胞活化，是NP發生、發展的重要機制[10]。然而，MCP-1不僅在DRG中表達，激活的星形膠質細胞體外也可產生MCP-1。研究表明，MCP-1在脫髓鞘病變、機械損傷、軸突橫斷及局灶性腦缺血后的星形膠質細胞中也表達[11]。此外，MCP-1在腫瘤壞死因子-α(TNF-α)刺激后的體外培養星形膠質細胞及脊髓損傷后的脊髓星形膠質細胞中表達升高[12]。本研究發現SNL后，參與調控NP的重要核團杏仁核中的MCP-1水平升高，但導致其MCP-1升高的具體機制尚不清楚。

目前有兩種mTOR作為核心組分與其他不同蛋白形成的復合物，包括mTOR復合物1 (mTORC1)和mTOR復合物2(mTORC2)。在一般情況下，mTORC1由raptor、mLST8和mTOR構成，通過磷酸化下游效應分子來影響其表達，如4E-BPs和p70核糖體S6Ks。mTOR、S6K1和4E-BP1在哺乳動物神經系統中表達，尤其是在脊髓背角[13]。由于淺表背角是外周傳入神經向中樞神經系統的第一個突觸部位，在調節痛覺和嗎啡耐受方面起著重要作用[14]，故mTOR在SCI后的機械和熱痛覺過敏調控中發揮重要作用。

MCP-1被證明能通過不同的機制調節疼痛，尤其對MCP-1(外周敏化)的外周機制研究較為透徹。如DRG神經元釋放MCP-1可激活鄰近傷害感受神經元的CCR2，通過激活瞬時受體電位香草酸亞型1(TRPV1)通道來提高這些神經元的興奮性并抑制電壓依賴性鉀通道[15]。近年來MCP-1的中樞機制也成為研究熱點。脊髓注射MCP-1可激活野生型脊髓小膠質細胞而不是CCR2基因敲除小鼠[16]。神經損傷引起的脊髓小膠質細胞激活可通過MCP-1抗體來緩解。此外，脊髓小膠質細胞中神經損傷誘導脊髓小膠質細胞中p38激活在CCR2基因敲除小鼠中較輕[17]。由于小膠質細胞的激活是NP產生的關鍵，MCP-1可能通過這種機制增強NP。

研究發現，JNK是MAPK家族成員之一，可在神經損傷后的脊髓星形膠質細胞中持續活化，而JNK抑制劑SP600125可改善脊髓損傷后的NP癥狀[5-6]。雖然JNK通路和MCP-1通路均參與了NP的調控，但杏仁核中JNK/MCP-1信號通路是否參與神經病理性疼痛的調控尚未見報道，本研究對其進行了初步的探討。

本研究結果表明，SNL誘導后杏仁核的p-mTOR、p-JNK表達持續增強，且該增強效應呈時間依賴性，表明在脊髓損傷引發NP的過程中，杏仁核中的mTOR和JNK途徑均被激活。進一步分析顯示，d12的p-mTOR、p-JNK表達與MCP-1水平呈正相關，提示兩個途徑可能參與了杏仁核中MCP-1/CCR2途徑的激活。杏仁核注射p-mTOR、p-JNK抑制劑發現，MCP-1水平及陽性細胞數均降低，提示兩條通路的激活可能參與了杏仁核MCP-1的釋放增多。此外，采用化學手段抑制兩條通路活性可減輕脊髓損傷引起的NP癥狀，提示兩條通路在NP治療中有重要意義，可作為NP防治的靶點。

綜上所述，在NP中mTOR和JNK通路激活，抑制mTOR和JNK通路可達到緩解NP大鼠疼痛及杏仁核MCP-1升高的作用，對于NP的治療有一定意義。