絕經期H型高血壓大鼠模型的建立*

謝 容，陳 建，陳 鍵，洪秀琴，2△

(1.湖南師范大學附屬第一醫院/湖南省人民醫院科研部，長沙 410005；2.湖南省分子流行病學重點實驗室，長沙 410013；3.湖南省湘潭市疾病預防控制中心 411199)

原發性高血壓伴血漿同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)升高(Hcy>10 μmol/L)稱為H型高血壓[1]，約占總高血壓人群的80%[2]，H型高血壓患者罹患心腦血管疾病的風險較單純原發性高血壓增加。研究表明，H型高血壓患者腦卒中發生率為單純原發性高血壓患者的12.7倍[3]，心肌梗死發生率為單純原發性高血壓患者的5倍[4]。女性進入絕經期，體內雌激素水平持續下降，影響內皮功能的正常調節，內皮依賴性血管舒張降低，引起血壓明顯波動[5]。絕經期高血壓患者伴發高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia，HHcy)使病情控制難度增大，同時還增加心血管疾病發生風險。目前的動物研究以H型高血壓大鼠模型和雌激素匱乏型高血壓模型為主，鮮有對絕經期H型高血壓模型的探索。因此，本研究通過將H型高血壓大鼠模型和雌激素匱乏模型整合，探索絕經期H型高血壓動物模型的建立方法，并探討其可行性，從而為更好地研究這一特殊群體的病理生理特點提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

雌性無特殊病原體(SPF)級自發性高血壓(SHR)大鼠27只(北京維通利華公司)，6～8周齡，體重160～180 g。動物合格證號：SCXK(京)2016-0006。

1.1.2藥品與試劑

DL-蛋氨酸粉末(張家港市華昌藥業有限公司)；2%蛋氨酸飲水(2 g DL-蛋氨酸粉末加入雙蒸水定容至100 mL制備)。

1.1.3實驗儀器

BP-300A全自動大鼠無創血壓監測儀(成都泰盟軟件有限公司)；日立7600生化分析儀(日本HITACHI公司)，安圖A2000化學發光儀(鄭州安圖生物工程股份有限公司)，湘儀H1650R離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)。

1.2 方法

1.2.1實驗動物分組

SHR大鼠適應性喂養1周，分為con組、2%met組和ovx+2%met組，各9只。con組為正常對照組，進行假手術，普通飲水；2%met組為H型高血壓模型組，進行假手術，飲用2%蛋氨酸水；ovx+2%met組為絕經期H型高血壓模型組，進行雙側卵巢切除術，給予2%蛋氨酸水。

1.2.2實驗動物模型的制備

適應性喂養1周后，各組大鼠在無菌條件下進行腹腔麻醉注射。動物備皮后，ovx+2%met組采用背部雙切口進行大鼠雙側卵巢切除，假手術組(con組和2%met組)則在粉色卵巢組織周邊切除同等大小的脂肪。術后采用紅霉素抗感染處理。傷口愈合后，2%met組和ovx+2%met組用2%蛋氨酸水喂養，con組喂養普通飲用水。

1.2.3飲水量的記錄

以7 d為1個周期，每個周期第1天在大鼠飲水瓶加入250 mL水，1周后測量剩余飲水量，獲得大鼠的周飲水量，連續收集12周。

1.2.4大鼠收縮壓(SBP)的測量

利用BP-300A全自動大鼠無創血壓監測儀收集喂養后第2、4、6、8、10、12周的SBP。測量血壓前預熱無創血壓檢測儀，進行系統漏氣檢測。根據大鼠體重采用不同固定器固定。待大鼠平穩安靜后，將鼠尾插入加壓套至尾巴根部，將鼠尾脈搏傳感器置于鼠尾上1/3尾動脈處。

1.2.5血生化指標檢測

通過眼眶采血的方式收集大鼠血液標本后送至湖南省人民醫院馬王堆院區檢驗科進行血生化指標的檢測。利用安圖安圖A2000化學發光儀在喂養后第2周檢測雌二醇(E2)水平；利用日立7600生化分析儀在喂養第6、10、12周檢測Hcy水平，在喂養第12周檢測血漿葡萄糖(BS)、總蛋白(TP)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白(HDL)水平。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠周飲水量比較

3組平均周飲水量比較，差異有統計學意義(F=173.46，P<0.01)，且2%met組與ovx+2%met組周飲水量均明顯小于con組(P<0.01)，而2%met組與ovx+2%met組周飲水量無明顯差異(P>0.05)，見圖1。

2.2 各組大鼠血清Hcy水平比較

不同喂養時間各組間大鼠血清Hcy水平比較，差異均有統計學意義(P<0.01)；喂養第6周，ovx+2%met組大鼠血清Hcy水平明顯高于con組和2%met組(P<0.01)，con組與2%met組無明顯差異(P>0.05)；喂養第10周，ovx+2%met組和2%met組大鼠血清Hcy水平均明顯高于con組(P<0.01)，且ovx+2%met組與2%met組大鼠血清Hcy水平也有明顯差異(P<0.01)；喂養第12周，2%met組和ovx+2%met組大鼠血清Hcy水平均超過10 μmol/L，ovx+2%met組大鼠血清Hcy水平明顯高于2%met組(P<0.05)，且兩組血清Hcy水平均明顯高于con組(P<0.01)，見表1。

2.3 各組大鼠血清E2水平比較

喂養第2周，3組大鼠血清E2水平比較，差異有統計學意義(F=29.990，P<0.01)；ovx+2%met組大鼠血清E2水平明顯低于con組和2%met組(P<0.01)，且con組和2%met組大鼠血清E2水平無明顯差異(P>0.05)，見圖2。

圖1 大鼠周飲水量曲線圖

表1 各組大鼠不同喂養時間血清Hcy水平比較

a：P<0.01，與con組相比；b：P<0.01，與2%met組相比。

2.4 各組大鼠不同喂養時間SBP比較

喂養第8、10、12周，3組大鼠血清SBP水平比較，差異均有統計學意義(F=5.183，P<0.05；F=6.259，P<0.01；F=173.500，P<0.01)；ovx+2%met組與2%met組大鼠SBP在各時間點均高于con組，且從第8周開始，差異有統計學意義(P<0.05或0.01)，ovx+2%met組與2%met組大鼠SBP在各時間點均無明顯差異(P>0.05)，見圖3。

a：P<0.01，b：P<0.05，與con組相比。

2.5 各組大鼠生化指標水平比較

喂養第12周，3組大鼠血漿TC、HLD水平比較，差異均有統計學意義(P<0.01)；2%met組和ovx+2%met組大鼠血漿TC、HDL水平均明顯高于con組(P<0.01)，且ovx+2%met組大鼠血漿TC、HDL水平均明顯高于2%met組(P<0.01或0.05)，見表2。

表2 各組大鼠生化指標水平比較

3 討 論

兩側卵巢手術切除所致絕經稱為人工絕經，術后雌激素水平降低，可出現血管舒縮障礙。雙側卵巢切除術由于具有控制因素單一、手術成功率高和造模結果穩定等優點，目前已被廣泛應用于模擬絕經導致的雌激素水平匱乏[6-7]。預實驗與趙梓妍等[8]研究顯示，與經腹部的雙側卵巢切除術相比，經背部雙側卵巢切除術所造成的傷口小，輕微剝開切口處脂肪即可看到粉色輸卵管和卵巢組織，避免了探查過程造成的臨近臟器損害或腸扭轉。所以，本實驗采用雌性SHR大鼠經背部雙側卵巢切除術建立高血壓絕經模型。研究結果表明，與con組和2%met組相比，ovx+2%met組大鼠血清E2水平明顯降低。該現象可反映高血壓女性人工絕經后的雌激素水平狀態。

高蛋氨酸飲食可誘導HHcy的發生。Hcy是蛋氨酸的中間產物，當機體攝入過量的蛋氨酸時，會影響胱硫醚-β-合成酶的活性，使得胱硫醚合成受阻，Hcy代謝受阻[9]；同時，蛋氨酸過量使甜菜堿水平明顯降低，蛋氨酸再生障礙，造成Hcy堆積[10]。在通過飲食增加蛋氨酸負荷來制造HHcy模型的研究中，蛋氨酸常見濃度為0.5%～5.0%，造模成功時間從2周至3個月不等。任曉麗等[11]研究表明，SD大鼠給予5%蛋氨酸飲食在第8周時Hcy水平達到(10.07±0.09)μmol/L，而給予1%蛋氨酸飲食Hcy水平則為(9.04±0.06)μmol/L；同時，該研究提示飲食中蛋氨酸濃度>3%可能導致生長毒性。SHR大鼠是公認的模擬人類原發性高血壓發病機制最穩定、最具代表的實驗動物模型[12]。而蛋氨酸飼料屬于特殊飼料，難以獲得，自行制備不易。因此，本實驗采用SHR+2%蛋氨酸飲水構建H型高血壓大鼠模型。喂養第12周，2%met組血清Hcy水平達到(13.07±0.65)μmol/L，ovx+2%met組血清Hcy水平達到(14.20±1.29)μmol/L。根據H型高血壓的判定標準(Hcy>10 μmol/L)[1]，SHR大鼠經12周2%蛋氨酸飲水能建立穩定的H型高血壓大鼠模型。

Hcy水平升高是高血壓的危險因素之一。Hcy異常升高會引起內皮功能障礙，導致內皮細胞分泌的一氧化氮(NO)生成減少,血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、 內皮素(ET)生成增加。舒血管物質減少，縮管物質增加，血管舒張功能障礙，使血壓升高[13]。雌激素參與維持血壓調節。雌激素能激活血管內皮一氧化氮合酶(eNOS)，促進內皮細胞釋放NO并提高其生物利用度；降低AngⅡ水平，調節腎素-血管緊張素-醛固酮系統，發揮穩定血壓的作用[14-15]。有研究顯示，卵巢切除加重HHcy大鼠ET表達，使eNOS生成明顯降低，補充雌激素通過降低血漿Hcy水平并拮抗eNOS表達來減輕HHcy帶來的血管內皮細胞損害[16]。曹艷麗等[17]研究報道，喂養1周后，給予2%蛋氨酸飲水的SHR大鼠SBP明顯高于雙蒸水喂養組(P<0.05)；張志敏等[18]研究表明，從第8周起2%蛋氨酸組與對照組的SBP比較，差異有統計學意義(P<0.05)。本研究結果表明，2%蛋氨酸喂養的大鼠SBP在各時間點均高于cos組，且從第8周起，差異有統計學意義(P<0.01)，與上述文獻報道結果相似。但是，本研究中大鼠的SBP差異是否因切除卵巢后雌激素水平改變所致尚未能體現。

綜上所述，本實驗通過12周的2%蛋氨酸飲水+SHR大鼠卵巢切除術成功構建了穩定的絕經期H型高血壓實驗大鼠模型。