miR-101通過調控c-met對骨肉瘤細胞MG63惡性生物學行為的影響*

王若章，樓錦博，顧增輝

(中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇三醫院骨科，杭州 310013)

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是在兒童和成年人中常見的一種原發骨惡性腫瘤，由于具有高轉移率和高復發性，其有效治療一直是臨床從業者面臨的難題。微RNA(microRNA，miR)是一類非編碼RNA，其通過調控下游靶蛋白的轉錄與翻譯，參與多種生理過程。研究發現，miR-101在多種腫瘤中發揮抑癌作用，如促進結腸癌、肝癌及卵巢癌細胞凋亡，抑制癌細胞增殖、遷移和侵襲[1-3]。此外，本研究前期的生物信息學分析發現OS組織中存在差異性表達的基因，miR-101下調明顯，較正常骨組織下調5倍。研究發現，細胞間質上皮轉化因子(cellular-mesenchymal to epithelial transition factor，c-met)表達異常與多種癌癥有關，肝癌組織c-met表達上調，靶向抑制c-met蛋白表達可抑制癌細胞增殖，促進其凋亡[4]；此外，c-met抑制對轉移性腎細胞癌增殖、血管生成和癌細胞轉移有直接抑制作用，而且通過免疫檢查點發揮間接抗腎細胞癌作用[5]。miR-101是否能通過調節c-met的表達影響OS的惡性行為學仍需進一步研究。因此，本研究通過上調或下調MG63細胞中miR-101表達，探討miR-101對癌細胞增殖、凋亡和侵襲的影響及其具體機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞系

OS細胞MG63購自上海中科院細胞庫。

1.1.2儀器與試劑

miR-101模擬物(miR-101 mimic)、模擬物陰性對照片段(mimic-NC)、miR-101抑制劑(miR-101 inhibitor)、抑制劑陰性對照片段(inhibitor-NC)購自上海吉瑪制藥技術有限公司；miR-101、U6引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成；凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；c-met、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、磷酸化PI3K(p-PI3K)、絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(AKT)、磷酸化AKT(p-AKT)抗體購自美國Abcam公司；熒光定量PCR(qRT-PCR)儀購自美國ABI公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養與轉染

MG63細胞培養于含10%胎牛血清的培養基中，置于37 ℃ 5% CO2培養箱中，每2天更換1次培養液，待細胞融合度達到90%以上時，0.25%胰蛋白酶消化傳代。將對數生長期的第4代MG63細胞分為對照組、mimic-NC組、miR-101 mimic組、inhibitor-NC組、miR-101 inhibitor組。除對照組外，根據LipofectamineTM2000說明書將mimic-NC、miR-101 mimic、inhibitor-NC及miR-101 inhibitor分別轉染入對應組別的細胞中，顯微鏡下觀察轉染效果，轉染成功率達85%后，繼續培養48 h，用于后續實驗。

1.2.2qRT-PCR法檢測miR-101相對表達水平

收集轉染后處于對數生長期的MG63細胞，Trizol試劑盒提取總RNA，利用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板，按照SYBR Green試劑說明書進行PCR擴增，擴增條件為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸40 s，共40個循環，以U6為內參，以2-ΔΔCT表示miR-101相對表達水平，miR-101引物序列見表1。

表1 miR-101引物序列

1.2.3噻唑藍(MTT)法檢測細胞存活率

收集轉染后處于對數生長期的MG63細胞，DMEM培養基重懸，制成單細胞懸液，接種于96孔板，細胞密度為1×105/孔，置于培養箱中培養，24 h后每孔加入MTT溶液50 μL，4 h后棄去原有培養基，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，混合均勻后，室溫避光孵育10 min，置于波長為570 nm的酶標儀上測定吸光度(A570)值，并計算細胞存活率，細胞存活率(%)=(實驗組A570值/對照組A570值)×100%。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞凋亡率

收集轉染后處于對數生長期的MG63細胞于流式管中，3 000 r/min離心10 min，離心半徑8 cm，加入500 μL磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞2次，離心后加入500 μL結合緩沖液，制成細胞懸液，加入5 μL膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(annexin V-FITC)結合液混勻，再加入10 μL碘化丙啶(PI)充分混勻，避光冰浴15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.5Transwell實驗檢測細胞侵襲能力

取DMEM培養基稀釋后的基質膠100 μL鋪于Transwell小室的上室中，Transwell小室的下室中加入500 μL DMEM培養基，置于培養箱中培養24 h。取轉染48 h后的MG63細胞，制成細胞懸液，Transwell小室中加入150 μL細胞懸液，48 h后去除下室中的培養液，棉簽擦去Transwell小室內室膜上的細胞，多聚甲醛固定20 min，0.1%結晶紫溶液染色10 min，顯微鏡下觀察并拍照，計算侵襲細胞數。

1.2.6雙熒光素酶報告基因法檢測miR-101與c-met的靶向關系

生物信息學數據庫starBase預測miR-101與c-met具有靶向結合位點，構建包含靶向結合位點序列的c-met 3′-UTR野生型(c-met wt)和突變型(c-met mut)重組質粒。將第4代未經轉染的處于對數生長期的MG63細胞按1×105/孔的密度接種到24孔板，待細胞融合度達到80%時，將miR-101 mimic、mimic NC分別與c-met wt或c-met mut重組質粒共轉染MG63細胞，48 h后根據雙熒光素酶試劑盒說明書要求檢測熒光素酶活性，螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性比值表示熒光素酶的相對活性。

1.2.7Western blot檢測細胞中蛋白相對表達水平

收集轉染后處于對數生長期的MG63細胞，加入RIPA裂解液，冰上靜置30 min，12 000 r/min離心10 min，離心半徑為10 cm，吸取上清液，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白水平，加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃加熱10 min使蛋白變性。120 V恒壓電泳2 h，0.3 A恒流濕轉2 h，TBST洗膜3次，每次5 min，胎牛血清室溫封閉1 h，c-met、p-Akt、AKT、p-PI3K、PI3K、GAPDH蛋白一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次5 min。電化學發光(ECL)法顯色，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達水平。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 miR-101相對表達水平比較

對照組、mimic-NC組、miR-101 mimic組、inhibitor-NC組、miR-101 inhibitor組miR-101相對表達水平分別為2.02±0.11、2.05±0.16、6.82±0.15、2.03±0.18、1.10±0.15，組間比較，差異有統計學意義(F=678.132，P<0.001)。與對照組和mimic-NC組比較，miR-101 mimic組miR-101相對表達水平明顯升高(P<0.05)；與對照組和inhibitor-NC組比較，miR-101 inhibitor組miR-101相對表達水平明顯降低(P<0.05)；與miR-101 mimic組比較，miR-101 inhibitor組miR-101相對表達水平明顯降低(P<0.05)；對照組、mimic-NC組、inhibitor-NC組miR-101相對表達水平無明顯差異(P>0.05)。

2.2 細胞存活率比較

各組細胞存活率比較，差異有統計學意義(P<0.001)；與對照組和mimic-NC組比較，miR-101 mimic組細胞存活率明顯降低(P<0.05)；與miR-101 mimic組比較，miR-101 inhibitor組細胞存活率明顯升高(P<0.05)；對照組、mimic-NC組、inhibitor-NC組、miR-101 inhibitor組細胞存活率無明顯差異(P>0.05)，見表2。

2.3 細胞凋亡率比較

各組細胞凋亡率比較，差異有統計學意義(P<0.001)；與對照組和mimic-NC組比較，miR-101 mimic組細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與對照組和inhibitor-NC組比較，miR-101 inhibitor組細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；與miR-101 mimic組比較，miR-101 inhibitor組細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；對照組、mimic-NC組、inhibitor-NC組細胞凋亡率無明顯差異(P>0.05)，見表2、圖1。

2.4 侵襲細胞數比較

各組侵襲細胞數比較，差異有統計學意義(P<0.001)；與對照組和mimic-NC組比較，miR-101 mimic組侵襲細胞數明顯減少(P<0.05)；與對照組和inhibitor-NC組比較，miR-101 inhibitor組侵襲細胞數明顯增多(P<0.05)；與miR-101 mimic組比較，miR-101 inhibitor組侵襲細胞數明顯增多(P<0.05)；對照組、mimic-NC組、inhibitor-NC組侵襲細胞數無明顯差異(P>0.05)，見表2、圖2。

表2 各組細胞存活率、細胞凋亡率及侵襲細胞數比較

A：對照組；B：mimic-NC組；C：miR-101 mimic組；D：inhibitor-NC組；E：miR-101 inhibitor組。

A：對照組；B：mimic-NC組；C：miR-101 mimic組；D：inhibitor-NC組；E：miR-101 inhibitor組。

2.5 雙熒光素酶報告基因法檢測結果

轉染miR-101 mimic后，miR-101 mimic+c-met wt質粒的熒光素酶活性(0.44±0.06)較miR-NC+c-met wt質粒(1.05±0.08)明顯降低(t=10.566，P<0.001)；但對c-met mut質粒的熒光素酶活性無影響，miR-101 mimic+c-met mut與miR-NC+c-met mut質粒的熒光素酶活性分別為1.05±0.06、1.04±0.05，差異無統計學意義(t=0.222，P=0.835)。

2.6 細胞中c-met、p-PI3K及p-Akt相對表達水平比較

各組c-met、p-PI3K及p-Akt相對表達水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。與對照組和mimic-NC組比較，miR-101 mimic組c-met、p-PI3K及p-Akt相對表達水平均明顯降低(P<0.05)；與對照組和inhibitor-NC組比較，miR-101 inhibitor組c-met、p-PI3K及p-Akt相對表達水平均明顯升高(P<0.05)；與miR-101 mimic組比較，miR-101 inhibitor組c-met、p-PI3K及p-Akt相對表達水平均明顯升高(P<0.05)；對照組、mimic-NC組、inhibitor-NC組c-met、p-PI3K及p-Akt相對表達水平均無明顯差異(P>0.05)，見表3、圖3。

表3 各組細胞中c-met、p-PI3K及p-Akt相對表達水平比較

續表3 各組細胞中c-met、p-PI3K及p-Akt相對表達水平比較

A：對照組；B：mimic-NC組；C：miR-101 mimic組；D：inhibitor-NC組；E：miR-101 inhibitor組。

3 討 論

OS是骨骼系統常發生的惡性腫瘤，好發于長骨干骺端，常見于膝關節。目前對OS的治療以化療為主，但5年生存率不甚理想，所以OS仍是醫療上亟待解決的難題。既往研究表明，miRNA在OS的發生、發展中具有重要的調節作用，阻斷miR-27a-3p可降低紫杉醇耐藥骨肉瘤細胞的耐藥性，miR-329-3p可增強OS癌細胞順鉑敏感性，促進癌細胞凋亡，抑制癌細胞遷移和侵襲[6-7]。miR-101已被報道在多種腫瘤中發揮抑癌作用[8-9]，所以本研究通過敲降或上調MG63細胞中miR-101的表達，探討miR-101對OS的影響。

miR-101在結腸癌、肝癌等癌癥中均發揮抗癌作用，而且能逆轉肝癌細胞順鉑耐藥性[10-12]。在OS中，長鏈非編碼RNA DSCAM-AS1通過海綿吸附降低miR-101表達，癌細胞增殖、遷移和侵襲能力增強[13]；血清miR-101水平與總生存期有關，可作為OS臨床診斷和預后的一個重要生物標志物[14]。本研究通過將miR-101 mimic及miR-101 inhibitor轉染入MG63細胞，上調或下調細胞中miR-101的表達，探討miR-101對MG63細胞惡性行為學的影響。實驗結果表明，miR-101表達上調可抑制細胞增殖、促進細胞凋亡、降低細胞侵襲能力，而下調miR-101后，細胞增殖、侵襲能力增強，凋亡率降低。該結果提示，miR-101可抑制OS癌細胞增殖，促進其凋亡，增強其侵襲能力。

c-met激活后可調控下游多個信號轉導途徑，通過這些途徑調節多種生理過程，包括細胞增殖和分化。PI3K/Akt信號通路在促進細胞增殖和分化中發揮重要作用。已有研究表明，PI3K/Akt信號通路激活可促進食管鱗癌、皮膚鱗狀細胞癌的細胞遷移和侵襲[15-16]。研究發現，c-met可激活PI3K/Akt信號通路促進胰腺癌細胞增殖、浸潤和侵襲活性[17]。此外，miR-152激活c-met/PI3K/Akt信號通路可增強OS癌細胞對化療藥物吉西他濱的耐藥性，使OS預后不良[18]。但是抑癌因子miR-101在OS中發揮抑癌作用是否通過調節c-met/PI3K/Akt信號通路仍需進一步研究。本研究通過上調或敲降MG63細胞中miR-101的表達，探討miR-101對c-met/PI3K/Akt信號通路的影響，Western blot檢測c-met、p-PI3K、p-Akt表達水平，結果顯示，MG63細胞中c-met、p-PI3K、p-Akt表達升高，miR-101表達上調可降低c-met、p-PI3K、p-Akt表達，而下調miR-101后c-met、p-PI3K、p-Akt表達升高。結果提示，miR-101抑制OS中c-met/PI3K/Akt信號通路。

綜上所述，miR-101可抑制OS癌細胞增殖，促進其凋亡，增強其侵襲能力，并可能通過抑制c-met/PI3K/Akt信號通路發揮調控作用，為臨床治療OS提供了理論依據。但是本研究存在一定不足之處：(1)僅在細胞水平證明miR-101參與調控OS的生物行為學，缺乏體內研究進行佐證；(2)對于機制的研究僅檢測了上調或下調miR-101后，OS癌細胞中c-met/PI3K/Akt信號通路蛋白的表達情況，缺乏該信號通路對OS細胞惡性行為學的直接作用研究。因此，后期將補充體內實驗，建立OS移植瘤大鼠模型，上調或下調miR-101后，檢測移植瘤生長情況，并明確c-met/PI3K/Akt信號通路相關蛋白在腫瘤中的表達情況，完成體內和體外實驗的相互佐證。