辣椒炭疽病生防菌的篩選鑒定及其防治作用研究

劉曉然,夏 歡,王 陽

(西北農林科技大學 植物保護學院,陜西楊凌 712100)

辣椒富含多種營養物質[1],是中國蔬菜的核心產業之一,引入中國至今已經有400多年的歷史[2]。辣椒炭疽病是辣椒的三大病害之一,主要由辣椒炭疽菌(Colletotrichum capsici)引起,主要危害辣椒的葉片和果實,影響辣椒的產量和品質,一般減產10%～15%,嚴重時可減產40%以上,威脅辣椒產業的健康發展[3-4]。目前生產上主要釆用農業綜合防治[5]、培育抗病品種[6]、化學農藥防治[7-8]和生物防治[9-18]等措施來防治辣椒炭疽病。其中,生物防治因其環保、持效期長,對環境、生態和人類健康安全等優點,已經逐步成為研究熱點。

目前,國內外已報道多種生防菌株對辣椒炭疽病菌具有防治作用,主要有生防細菌[9-11]、生防放線菌[12-16]和生防真菌[17-18]。放線菌可以產生多種抗生素、植物激素、水解酶等抑菌活性物質,具有開發生物源農藥的潛力[19]。將生防放線菌制備成活細胞制劑,不僅可以改善土壤結構,降低農藥殘留,而且環境兼容性好,持效期長[20]。本研究以辣椒炭疽病菌為靶標菌,從健康辣椒植株根部篩選得到2株廣譜高效的拮抗鏈霉菌,分別命名為LX-4、LX-18。通過對這兩株生防菌的作用機制和發酵液活性進行初步探索,為這兩株生防菌的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

生防菌:從陜西、河南等地健康辣椒根部土壤分離獲得。

供試病原真菌有13種,分別為L01:辣椒炭疽病原菌(Colletotrichum capsici)、L02:煙草赤星病菌(Alternaria alternate)、L03:番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、L04:蘋果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、L05:玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)、L06:小 麥 赤 霉 病 菌(Fusarium graminearum)、L07:油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、L08:白菜黑斑病菌(Alternariabrassicae)、L09:梨 腐 爛 病 菌(Valsaambiens)、L10:小麥莖基腐病菌(Fusarium pseudograminearum)、L11:香 蕉 葉 枯 病 菌(Pseudocer cosporafijiensis)、L12:石榴干腐病菌(Coniella granati)、L13:黃瓜靶斑病菌(Corynespora cassiicola),由西北農林科技大學蔬菜病害及生物防治實驗室保存提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 生防菌的篩選及抑菌活性檢測 用土壤稀釋法[21]從健康辣椒植株的根際土壤樣品中分離、純化得到放線菌,以辣椒炭疽病菌等13種病原真菌為靶標進行篩選,采用平板對峙法測定土壤放線菌的拮抗作用。于PDA上劃線培養生防菌,并在距其4 cm的位置接種靶標菌菌餅(D=6 mm),以僅接種靶標菌的培養基作為對照,28℃恒溫培養,記錄抑菌帶寬度。每個處理重復3次,記算抑菌帶寬度。

1.2.2 生防菌多相分類鑒定 形態特征觀察:將2株生防菌劃線接種于ISP3培養基上,在培養基上45°角傾斜插入無菌蓋玻片,培養至菌絲孢子長出后取出蓋玻片制成掃描樣品,用掃描電子顯微鏡觀察其菌絲和孢子特征并拍照。

培養特征觀察:將2株生防菌接種于PDA培養基、GS培養基以及ISP1、ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、ISP6和ISP7培養基,28℃恒溫生長15 d,依據《鏈霉菌鑒定手冊》[21]觀察并記錄兩株菌株生長狀況是否良好,以及基內菌絲、氣生菌絲的顏色和是否產生可溶性色素,作為兩株生防鏈霉菌定種的依據。

生理生化測定:生防鏈霉菌的多項生理生化指標參考《鏈霉菌鑒定手冊》[22]進行測定。

16S r DNA測序及進化樹構建:參照CATB方法提取放線菌DNA進行16S r DNA基因序列的PCR擴 增,引 物:27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′,濃度10μmol/L;反應體系(25 μL):Master Mix 12.5μL,上游引物1μL,下游引物1μL,基因組DNA模板2μL,dd H2O 8.5 μL;反應條件:94℃預變性5 min,94℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸90 s,循環35次,最后72℃延伸10 min。擴增產物由擎科生物科技有限公司進行測序,將測序結果在EzBioCloud網站進行同源序列比對,用MEGA 6.06軟件進行序列分析并構建系統進化樹[23]。

1.2.3 生防放線菌對辣椒出芽率以及對辣椒幼苗生長的影響 將2株生防菌在PDA培養基上劃線培養7 d后,用無菌水沖洗收集孢子,通過血球計數板計數配制濃度為107CFU/m L的孢子懸浮液。用兩株菌的孢子懸浮液分別對消毒的辣椒種子進行拌種,然后種植到盛有滅菌基質的育種穴盤內,每組種植60株,以無菌水處理作為對照,7 d后統計辣椒的出苗率,然后將每組處理選取15株長勢均勻的辣椒幼苗移栽到小花盆中,20 d后統計其株高和根長。每處理重復3次。

1.2.4 生防放線菌次生代謝產物檢測 參照Awla等[24]的研究方法測定菌株的產幾丁質酶、產β-1,3-葡聚糖酶、產蛋白酶、產纖維素酶、產脂肪酶、產噬鐵素能力、產ACC脫氨酶能力。

1.2.5 放線菌發酵液中抗真菌活性成分的初步探究 PDB培養液中接種兩株放線菌菌餅(D=6 mm),28℃、180 r/min恒溫振蕩培養7 d獲得兩株菌的發酵液,5 000 r/min離心10 min收集發酵上清液,隨后按照極性從小到大分別依次加入二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取,旋轉蒸發干燥后收集3種有機相中的物質并稱重。取各個萃取相的物質溶于甲醇中配制成濃度為100 μg/m L的溶液,取各相甲醇溶液100μL與10 m L PDA混勻后倒平板,以加等量甲醇的PDA作為對照,28℃培養5 d后用十字交叉法測量對照組和各處理組的菌落直徑,試驗重復3次,抑制率計算公式如下:

菌絲生長抑制率=(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/對照組菌落直徑×100%

1.2.6 發酵濾液穩定性檢測 分別從溫度、p H、紫外光處理和光照處理4個方面分析放線菌發酵液的穩定性。將待測菌株的發酵濾液分別在20℃、40℃、60℃、80℃、100℃下處理1 h,在紫外燈下分別照射30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min、210 min、240 min,日光燈下分別照射12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h,調節發酵濾液的p H為2、4、6、8、10、12處理1 h后調回原始值。取1.5 m L處理后的發酵濾液與15 m L PDA培養基混勻后倒板,以加1.5 m L無菌水的PDA作為對照,28℃培養5 d后用十字交叉法測量各處理組和對照組的菌落直徑,試驗重復3次,計算抑制率。

1.3 數據分析

采用IBM SPSS Statistics 21.0對試驗數據進行統計學分析,采用Duncan’s多重比較法進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 拮抗放線菌篩選

拮抗放線菌篩選結果表明(表1),LX-4、LX-18兩個菌株呈現出廣譜的抗真菌活性,對供試的13種不同病原真菌均有抑制作用,其中LX-18對13種病原菌的抑菌半徑均大于10 mm。LX-4、LX-18均對辣椒炭疽病菌有很強的抑制作用,LX-4對辣椒炭疽病菌抑菌半徑寬達14.33 mm,LX-18對辣椒炭疽病菌抑菌半徑寬達21.33 mm(圖1)。

圖1 生防菌株對辣椒炭疽菌的皿內抑菌效果Fig.1 Antagonistic effect of biocontrol strains against Colletotrichum capsici in dishes

表1 兩株放線菌對13種植物病原真菌的抑制作用Table 1 Inhibitory effects of two actinomycetes on 13 plant pathogenic fungi

2.2 放線菌分類鑒定

2.2.1 掃描電鏡觀察 掃描電鏡下觀察到菌株LX-4菌絲豐富,無橫隔、無斷裂,孢子絲鏈狀卷曲,孢子橢圓狀,兩端略扁,表面較粗糙,孢子長度大約1～2μm;菌株LX-18菌絲豐富,無橫隔、無斷裂,孢子絲長鏈狀,孢子為表面光滑的短桿狀,孢子長度大約0.5～2μm(圖2)。

圖2 LX-4和LX-18掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron microscope of LX-4 and LX-18

2.2.2 培養特征觀察 觀察結果顯示(表2),菌株LX-4氣生菌絲多呈灰白色,基內菌絲在不同培養基上顏色有差別,主要有黃色、白色、磚紅色,在所有測試培養基上均不產生可溶性色素,在ISP2、ISP3、ISP7、PDA培 養 基 上 長 勢 好,在ISP1、ISP4、ISP6、GS培養基上長勢差;菌株LX-18的氣生菌絲在ISP1上呈現淡黃色,在其他培養基上多呈灰色或白色,基內菌絲在不同培養基上顏色有差別,主要有灰白色、灰黃色、黃褐色,在ISP6培養基上產生棕黑色可溶性色素,在ISP2、ISP3、ISP5、ISP7、PDA培 養 基 上 長 勢 好,在ISP1、ISP4、ISP6培養基上長勢差。

表2 兩株放線菌的培養特征觀察Table 2 Culture characteristics of two actinomycetes

2.2.3 生理生化鑒定結果 生防放線菌LX-4和LX-18的相關生理生化指標特征測定結果(表3)表明,生防菌LX-4和LX-18均能產生接觸酶;LX-4菌株有良好的明膠液化能力,吲哚試驗顯陽性,無淀粉水解能力;LX-18菌株有良好的淀粉水解能力,無明膠液化能力,吲哚試驗顯陰性,兩株菌均沒有產硫化氫和黑色素的能力。

表3 兩株放線菌的生理生化特征Table 3 Physiobiochemic character of two actinomycetes

2.2.4 生防放線菌的16S r DNA序列的系統發育分析 16S r DNA序列的同源性分析結果顯示,菌株LX-4與Streptomyces angustmyceticus(NRRL B-2347)有最高的序列相似性99.93%,并在78%水平聚在進化樹上同一支,LX-4最終鑒 定 為S.angustmyceticus;菌 株LX-18和Streptomyces luteogriseus(NBRC 13402)有最高的序列相似性100%,并在99%水平上聚在進化樹上的同一支,LX-18最終鑒定為S.luteogriseus(圖3)。

圖3 菌株LX-18和LX-4的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strains LX-18 and LX-4

2.3 生防放線菌對辣椒出芽率的影響及對辣椒幼苗的促生作用

在播種后第7天統計各組的出芽率,結果顯示,生防菌LX-4和LX-18處理較對照出芽率無顯著性差異。在播種后第20天測量了各處理組辣椒幼苗的株高和根長,結果表明,生防菌LX-4和LX-18處理較對照株高均有所提高,增幅分別為21.61%和6.89%;生防菌LX-4和LX-18處理較對照根長也均有所增長,且差異均達顯著水平,增幅分別為6.76%和27.48%(表4)。綜上可知,LX-4和LX-18對辣椒的生長均有促進作用,LX-4主要能夠增加辣椒的株高,LX-18主要能夠增加辣椒的根長。

表4 兩株生防菌下辣椒種子出苗率和幼苗生長Table 4 Seed emergence rate and seedling growth of pepper under treatment of two biocontrol strains

2.4 生防放線菌次生代謝產物檢測

檢測結果表明:菌株LX-4能產生β-1,3-葡聚糖酶、蛋白酶、脂肪酶、鐵載體等次生代謝產物;菌株LX-18能產生β-1,3-葡聚糖酶、蛋白酶、脂肪酶、ACC脫氨酶、纖維素酶和鐵載體等次生代謝產物(表5)。LX-4和LX-18均能產生β-1,3-葡聚糖酶、蛋白酶、脂肪酶具有降解真菌細胞細胞壁的能力,并能夠產生鐵載體具有促進辣椒植株生長的能力。

表5 兩株放線菌產生次生代謝產物的能力Table 5 Ability of two strains of actinomycetes to produce secondary metabolites

2.5 放線菌發酵液中抗真菌活性成分的初步探究

兩株生防菌發酵液的二氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相粗提物對辣椒炭疽菌的抑制作用如圖4所示,結果表明,LX-4和LX-18的3種有機相提取物均有抑菌活性,活性產物種類豐富。菌株LX-18發酵液的乙酸乙酯相的抑菌率更高,正丁醇相的抑菌率低,說明發酵液里的主要抑菌物質極性較小;菌株LX-4的正丁醇相的抑菌活性高,二氯甲烷相的抑菌率低,發酵液里的主要抑菌物質極性較大(圖4)。

圖4 兩株菌的抑菌活性成分分布Fig.4 Distribution of inhibition activity components of two strains

2.6 發酵濾液穩定性檢測

如圖5所示:LX-4和LX-18發酵液的抑菌活性在40℃以內活性穩定,隨著溫度的升高抑菌活性不斷下降;LX-4在酸性環境和堿性環境中抑菌活性都較穩定,LX-18在堿性環境中活性穩定,在酸性環境中抑菌活性降低;LX-4和LX-18發酵液在可見光條件下有較好的穩定性,LX-4在可見光連續照射96 h條件下較對照無顯著差異,LX-18在可見光連續照射24 h時活性輕微下降;LX-4和LX-18發酵液在紫外照射60 min后活性顯著降低,并隨著時間的延長逐漸降低。綜上所述,LX-4和LX-18發酵液的的抑菌活性分別在p H 2～12和p H 6～12下穩定,均能在溫度低于40℃時和光照96 h內穩定,在紫外照射下活性降低。

圖5 不同處理兩株菌發酵液抑菌活性Fig.5 Inhibition activities of two strains under different treatments

3 討論與結論

辣椒炭疽病已成為全球性病害,在成熟的果實上發生嚴重造成巨大的經濟損失。而且引起辣椒炭疽病的病原真菌復雜多樣且經常混合發生,病害一旦發生后防治困難,化學殺菌劑在一定程度上可以防治該病害,但化學農藥的持續使用對蔬菜安全和農業可持續發展造成了不良影響[25]。目前,國家政策要求對農藥減施增效,利用生防菌防治辣椒炭疽病成為一個有價值的課題,國內外已報道了多株對辣椒炭疽病有防治效果的生防菌[9-18]。

本研究通過皿內對峙篩選出LX-4(S.angustmyceticus)和LX-18(S.luteogriseus)兩株鏈霉菌,對供試的13種病原菌均有抑制作用。Prisana等[12]在2019年報道了S.angustmyceticus對炭疽菌和新月彎孢菌引起的結球白菜葉斑病有很好的防治作用,能夠釋放出揮發性抗真菌化合物,包括醇類、醛類、羧酸類和脂肪酸類,還可以產生多種細胞壁降解酶;藤黃灰鏈霉菌S.luteogriseus抑菌活性產物種類豐富,人們相繼從其發酵液中分離出寡霉素A和C[26]、氨基酸抗生素KT-151[27]等抑菌活性產物,對多種病害都有明顯的抑制作用。因此,LX-4和LX-18兩株鏈霉菌均有廣譜抑菌活性,具有一定的生防潛力。

土壤微生物與植物之間相互作用,植物將光合作用產生的有機物釋放到土壤,供給微生物能源,微生物則將蛋白質、淀粉等大分子物質分解成無機養分釋放到土壤中,被植物作為營養源吸收[28],通過增加植物營養來促進植物的生長和發育。此外,植物還可以通過分泌植物激素,產生鐵載體等方式促進植物生長。本研究篩選出的兩株鏈霉菌LX-4和LX-18均能促進辣椒的生長,LX-4對辣椒株高的增幅達到21.61%,LX-18對辣椒根長的增幅達到27.48%。次生代謝產物檢測結果顯示LX-4和LX-18均能產生蛋白酶、脂肪酶和鐵載體,初步揭示了兩株生防菌的促生機制。

生防菌可以通過生產抗生素、揮發性化合物、合成降解真菌細胞壁的胞外酶、誘導系統抗性以及對營養物和生態位的競爭等方式,保護植物不受各種病原體的影響。真菌的細胞壁主要成分有幾丁質、纖維素、葡聚糖、蛋白質和類脂等,生防菌通過產生相關酶類來抑制病原真菌。結果表明LX-4和LX-18均能分泌β-1,3-葡聚糖酶、纖維素酶等次生代謝產物,推測它們能夠降解辣椒炭疽病菌的真菌細胞壁而表現出一定的抑制作用。LX-4和LX-18發酵液的二氯甲烷相、乙酸乙酯相和正丁醇相的粗提物均有抑菌活性,說明兩株菌能夠產生豐富的活性物質。LX-18的乙酸乙酯相粗提物抑菌活性高,該菌主要產生小極性的抑菌活性化合物;LX-4的正丁醇相物質抑菌活性高,該菌主要抑菌活性化合物極性較大。本研究以辣椒炭疽病菌為靶標菌,對LX-4和LX-18的發酵液進行穩定性檢測。結果顯示,LX-4的發酵液在強酸堿條件下和可見光處理后較穩定,在高溫和紫外條件下,抑菌活性明顯下降;LX-18的發酵液在堿性條件和可見光處理后較穩定,在酸性、高溫和紫外條件下,抑菌活性明顯下降。發酵液穩定性測定和初步萃取分離為后續這兩株菌的活性物質的分離純化以及產品的開發提供理論依據。

綜上所述,本研究篩選到兩株生防鏈霉菌LX-4和LX-18,次生代謝產物豐富,具有廣譜抗真菌活性并能促進辣椒幼苗生長。兩株菌的發酵液穩性較強,在病害防治上有良好的應用前景,其實際應用還需進行大田試驗驗證。