連作西洋參根際土壤化感物質(zhì)篩選及化感效應(yīng)分析

李 麗,蔣景龍,董艷鑫,舒 瑜

(1.陜西省催化基礎(chǔ)與應(yīng)用重點實驗室,陜西理工大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,陜西漢中 723001;2.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院,陜西漢中 723001)

連作障礙是一種普遍現(xiàn)象,在農(nóng)作物和藥用植物的種植中普遍存在[1-2]。西洋參(Panax quinquefoliusL.)與人參(Panax ginsengC.A.Mey.)、三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)同為五加科人參屬藥用植物,是中國傳統(tǒng)的中藥材,具有非常重要的醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)價值[3-4]。西洋參野生資源少,目前醫(yī)藥所用大多是栽培獲得的,然而,連作障礙導(dǎo)致藥材品質(zhì)退化,長期制約著西洋參產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[5]。根系分泌的化感物質(zhì)對植株產(chǎn)生的毒害作用可能是連作障礙的主要成因,董艷鑫等[6]研究發(fā)現(xiàn),重茬土壤浸提液和西洋參水提液能夠改變新土土壤的理化性質(zhì)和酶活性,同時能夠抑制西洋參幼苗的存活率,對西洋參幼苗的生長和生理也有顯著影響,但對其產(chǎn)生影響的重要成分尚不明確,而重茬土壤浸提液中哪些物質(zhì)是西洋參分泌的同樣不明確,自毒物質(zhì)對西洋參產(chǎn)生毒害作用的調(diào)控機制目前并不清楚。

代謝組學(xué)可對生物體內(nèi)或特定條件下的樣本中所有代謝物進(jìn)行全面、無偏性的高覆蓋檢測,可尋找和鑒定出不同樣品的差異代謝物,從而實現(xiàn)代謝特征的比較[7]。本研究用4 a生西洋參根水提液及其根際土壤浸提液澆灌新土栽培的西洋參幼苗,模擬西洋參重茬環(huán)境。采用液質(zhì)聯(lián)用(LCMS)的非靶向代謝組學(xué)技術(shù)對西洋參水提液及其根際土壤浸提液處理的西洋參土壤成分進(jìn)行全面鑒定,同時對所測得的數(shù)據(jù)進(jìn)行QC質(zhì)控分析和統(tǒng)計學(xué)分析,篩選差異代謝物,以期尋找引起西洋參連作障礙發(fā)生的潛在化感物質(zhì),為西洋參連作障礙提供理論基礎(chǔ),并為今后緩解西洋參連作障礙方面的研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 4 a生西洋參及其根際土壤于2019年11月5日采自陜西省漢中市留壩縣火燒店,4 a生西洋參及其根際土壤采集、西洋參水提液(GT)及其根際土壤浸提液(ST)制備參照董艷鑫等[6]方法。

1.1.2 儀器及試劑 質(zhì)譜儀(Q ExactiveTMHFX,Thermo Fisher),色譜儀(Vanquish UHPLC,Thermo Fisher),高效液相色譜儀(Waters e2695,Waters),低溫離心機(D3024R,Scilogex),甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨、二氯甲烷均為色譜純,氨水和磷酸為分析純。Ginsenoside Rg3、Ginsenoside Rg2、Indole-3-acetic acid、Methyl indole-3-acetate、Marmesin和Cytisine標(biāo)準(zhǔn)品均購自上海源葉生物科技有限公司;Senecionine標(biāo)準(zhǔn)品購自成都德斯特生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 西洋參幼苗栽培處理 挑選大小均一、已露白2 mm的西洋參種子,將其播種到已滅菌的營養(yǎng)土中,每40粒1盤(31.5×24.5×9.5 cm)(5 kg土壤/盤),設(shè)置蒸餾水對照組(CK),西洋參根水提液(GT)處理組和土壤浸提液(ST)處理組,每組3個重復(fù)。在晝/夜溫度為24℃/21℃,光照條件為光照12 h/黑暗12 h的培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng),1周澆灌2～3次,每次300 m L,處理90 d時分別收取西洋參幼苗栽培土,過1 mm篩,土壤樣品用液氮淬滅后分成兩份,一份用于代謝組學(xué)分析,另一份用于高效液相色譜驗證。營養(yǎng)土購自申之北有機土店,為長白山營養(yǎng)有機土,質(zhì)量為10 kg±0.1 kg,有機質(zhì)≥30%,p H為4.8～6.5,執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為Q/SZB001-2018。白菜種子購自漢中市特優(yōu)蔬菜種子公司。

1.2.2 代謝物的提取 分別稱取100 mg土壤樣本,用液氮研磨,加入500μL含0.1%甲酸的80%甲醇溶液,震蕩均勻后冰浴5 min,15 000 r/min、4℃離心10 min,取上清加質(zhì)譜級水稀釋至甲醇含量為53%,于4℃、15 000 r/min、離心10 min,吸取上清液,進(jìn)樣,進(jìn)行LC-MS分析[8]。從每個試驗樣本中取等體積樣本混勻作為數(shù)據(jù)質(zhì)量控制(quality control,QC)樣本,用于評估LCMS系統(tǒng)的再現(xiàn)性與可靠性,并進(jìn)行上機檢測分析。

1.2.3 LC-MS檢測 采用LC-MS技術(shù)分析蒸餾水(CK),4 a生西洋參水提液(GT)及其根際土壤浸提液(ST)澆灌的西洋參幼苗栽培土代謝譜。色譜柱:Hypesil Gold column(C18),在正離子模式(Posion mode,POS)下,流動相為0.1%甲酸(A)和甲醇(B)為流動相;在負(fù)離子模式(negion mode,NEG)下,流動相為p H 9.0,5 mmol/L乙酸銨(A)和甲醇(B)為流動相。電噴霧離子源(electrosprayionization,ESI)參數(shù)設(shè)置如下:噴霧電壓,3.2 k V;鞘氣流速40 arb;輔助氣流速10 arb;320℃;掃描范圍70～1 050 m/z。

1.2.4 高效液相條件 分別取蒸餾水(CK),4 a生西洋參水提液(GT)及其根際土壤浸提液(ST)澆灌的西洋參幼苗栽培土土壤2 g,分別加入2.0 m L色譜甲醇,超聲提取30 min,提取2次,合并濾液,12 000 r/min離心5 min,上清液濃縮后定容至1 m L,過0.22μm濾膜,為Ginsenoside Rg3、Ginsenoside Rg2和Methyl indole-3-acetate、Indole-3-acetic acid、Senecionine和Marmesin供試液。3個組分別取土壤2 g,分別加入5.0 m L二氯甲烷和40%氨水混合液(V∶V=25∶1),超聲提取2 h后浸提過夜,12 000 r/min離心5 min,上清液水浴揮干后定容至1 m L,過0.22μm濾膜,為Cytisine供試液。

分別精密稱取Ginsenoside Rg3、Ginsenoside Rg2、Indole-3-acetic acid、Senecionine、Methyl indole-3-acetate、Marmesin、Cytisine標(biāo)準(zhǔn)品,加色譜甲醇配制成1.0 mg/m L的對照品標(biāo)準(zhǔn)單品溶液。取Ginsenoside Rg3、Ginsenoside Rg2、Senecionine、Cytisine單標(biāo)溶液0.5 m L,色譜甲醇3.5 m L混合振蕩搖勻,即為125μg/m L的母液,用色譜甲醇依次進(jìn)行2倍稀釋,共6次;Indole-3-acetic acid和Methyl indole-3-acetate同上述方法配制成125μg/m L對照品溶液,隨后稀釋7次;Marmesin配制成3.91μg/m L對照品溶液,隨后稀釋6次。

色譜條件見表1。進(jìn)液量20μL。

表1 色譜條件Table 1 Chromatographic condition

1.2.5 化感作用驗證 將白菜種子用75%酒精消毒10 s,隨后沖洗干凈。在40℃下,水浴10 min。將種子放入培養(yǎng)皿中,分別向培養(yǎng)皿中加入0.008 L 0.001 mg/m L、0.01 mg/m L和0.1 mg/m L的Ginsenoside Rg3、Ginsenoside Rg2、Indole-3-acetic acid、Methyl indole-3-acetate、Marmesin、Cytisine和Senecionine溶液,以蒸餾水為對照。置于(25±1)℃的培養(yǎng)間中培養(yǎng),培養(yǎng)期間每隔12 h添加0.002 L提取液保持濕潤,胚根露白0.002 m記為發(fā)芽。每隔12 h記錄種子發(fā)芽數(shù),一周后測量其根長和莖長。每皿20粒,每個處理3個重復(fù)。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析 下機數(shù)據(jù)簡單篩選后,對峰面積進(jìn)行定量分析。根據(jù)定量結(jié)果進(jìn)行歸一化處理,得到最終結(jié)果。使用MetaX軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換及標(biāo)準(zhǔn)化處理。將所有試驗樣本和QC樣本提取得到的峰,經(jīng)UV尺度化(univariate scaling,單變量標(biāo)準(zhǔn)化)處理后進(jìn)行偏最小二乘判別分析(projection to latentstructures-discriminant analysis,PLS-DA)及模型驗證。以PLS-DA模型第一主成分的變量投影重要度(variable importance in the projection,VIP)＞1.4和P＜0.001(t檢驗)為標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)行差異代謝物的篩選。

發(fā)芽率=發(fā)芽數(shù)/種子總數(shù)×100%

利用Excel 2016軟件處理數(shù)據(jù),SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計分析,Duncan氏法進(jìn)行多重比較,Graph Pad Prism 5.01進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 QC質(zhì)控分析

代謝組具有易受外界因素干擾且變化迅速的特點,因此,為了獲得可靠且高質(zhì)量的代謝組學(xué)數(shù)據(jù),通常需進(jìn)行質(zhì)量控制(quality control,QC)。正負(fù)離子模式下,QC樣本相關(guān)性均大于0.98(圖1-A、圖1-B),表明整個檢測過程中,穩(wěn)定性較好,數(shù)據(jù)質(zhì)量較高,為后續(xù)代謝物分析結(jié)果的準(zhǔn)確性提供可行性。在正離子模式下,3組樣品在PC1和PC2維度上有較好分離(圖1-C),在負(fù)離子模式下,3組樣品在PC1和PC2維度上沒有正離子模式下分離程度好(圖1-D)。在正負(fù)離子模式下,3組樣品以及QC樣本均出現(xiàn)組內(nèi)聚集現(xiàn)象,說明組內(nèi)重復(fù)性比較好,數(shù)據(jù)具有可信度。此外,CK組與ST組分離程度較 低,而GT組 與CK組和ST組分離程度較高,說明CK組與ST組代謝物具有較高相似性,GT組與CK組和ST組代謝物具有較低相似性。

圖1 檢測數(shù)據(jù)質(zhì)控分析Fig.1 Quality control analysis of test data

2.2 PLS-DA多元統(tǒng)計分析

建立PLS-DA模型(圖2-A)進(jìn)行樣品類別的預(yù)測。各組均出現(xiàn)組內(nèi)聚集現(xiàn)象,說明重復(fù)性較好,且在兩種模式下,除CK與ST組距離較近外,CK組與GT組,GT組與ST組區(qū)分較為明顯。PLS-DA模型經(jīng)過七次循環(huán)交互驗證,得到的R2(模型對分類變量Y的解釋度)和Q2(模型的預(yù)測性)對模型有效性進(jìn)行評判,在兩種模式下,各組R2和Q2均接近1,說明建立的模型穩(wěn)定可靠。為了判別模型質(zhì)量好壞,對模型進(jìn)行排序驗證(圖2-B),兩種模式下R2均大于Q2,表明模型建立良好,不存在過擬合現(xiàn)象。

圖2 PLS-DA得分散點圖及排序驗證圖Fig.2 PLS-DA get scatter plot and sort verification plot

2.3 差異代謝物分析

設(shè)定閾值為VIP＞1.0,FC＞1.5或FC＜0.667且P＜0.05,篩選差異代謝物。在POS模式下,3組共檢測到代謝物646種,差異代謝物共249種,其中,174種上調(diào),75種下調(diào);在NEG模式下,3組共檢測到代謝物457種,差異代謝物共177種,其中,134種上調(diào),43種下調(diào)(表2)。根據(jù)化合物特征及性質(zhì),POS模式下鑒定出差異代謝物24種,其中皂苷類為17%、生物堿類為17%、酮類及黃酮類為17%、有機酸類為17%、萜類為12%、醇類為4%、香豆素類為4%,其他化合物占12%(圖3-A);NEG模式下鑒定出20種差異代謝物,其中酮類及類黃酮類占25%、脂類占20%、皂苷類占15%、萜類占10%、有機酸類占5%,其他化合物占25%(圖3-B)。此外,3組共有差異代謝物3種,POS模式下2種(圖3-C),為Genipin和Methyl indole-3-acetate;NEG模式下1種,為Indole-3-acetic acid(圖3-D)。

圖3 差異代謝物分類及統(tǒng)計Fig.3 Classification and statistics of differential metabolites

表2 差異代謝物統(tǒng)計分析Table 2 Statistical analysis of differential metabolites

以VIP＞1.4和P＜0.001的標(biāo)準(zhǔn),在已鑒定的差異代謝物中篩選出22種,其中在POS模式下有13種,在NEG模式下有9種(表3)。與CK組相比,GT組中13種上調(diào),2種下調(diào);ST組中7種上調(diào),1種下調(diào);其中Methyl indole-3-acetate在GT組和ST組中均上調(diào),Indole-3-acetic acid在GT組中上調(diào),在ST組中下調(diào)。

表3 GT-CK和ST-CK土壤差異代謝物Table 3 Different soil metabolites in GT-CK和ST-CK

2.4 HPLC驗證差異代謝物

為了驗證代謝組學(xué)的準(zhǔn)確性和進(jìn)一步驗證差異代謝物的變化,分別對3個處理組的土壤Ginsenoside Rg2、Ginsenoside Rg3、Indole-3-acetic acid、Methyl indole-3-acetate、Senecionine、Marmesin和Cytisine進(jìn)行HPLC檢測(圖4)。與CK組相比,GT組中Ginsenoside Rg3、Ginsenoside Rg2和Methyl indole-3-acetate含量顯著增加,分別增加1.35、0.85和2.07倍,而Indole-3-acetic acid含量減少23%;ST組中Methyl indole-3-acetate、Indole-3-acetic acid、Senecionine和Marmesin含量顯著增加,分別增加4.31、0.21、0.29和0.81倍,而Cytisine含 量 則 減 少18%。與ST組相比,GT組中Ginsenoside Rg3、Ginsenoside Rg2和Cytisine含量顯著增加,分別增加1.28、0.73和0.29倍,而Methyl indole-3-acetate、Indole-3-acetic acid、Senecionine和Marmesin含量顯著減少,分別減少42%、36%、22%和38%。此外,HPLC測定的7種差異代謝物與代謝組學(xué)結(jié)果呈正相關(guān)關(guān)系,R2為0.7101。總 體 上,GinsenosideRg2、Ginsenoside Rg3、Indole-3-acetic acid、Methyl indole-3-acetate、Marmesin、Cytisine和Senecionine含量變化與代謝組學(xué)的結(jié)果一致(圖5)。

圖4 高效液相色譜法檢測代謝物色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of various metabolite

圖5 差異代謝物與代謝組學(xué)相關(guān)分析Fig.5 Correlation analysis between differential metabolites and metabolomics

2.5 差異代謝物化感作用驗證

以不同濃度的差異代謝物處理白菜種子,發(fā)現(xiàn)白菜種子的萌發(fā)受到明顯影響(表4),與CK組相比,0.001 mg/m L和0.01 mg/m L Indole-3-acetic acid處理的白菜種子發(fā)芽率均表現(xiàn)出明顯抑制作用,而Ginsenoside Rg3、Ginsenoside Rg2、Methyl indole-3-acetate、Marmesin、Cytisine和Senecionine處理的白菜種子萌發(fā)率則無顯著變化;0.1 mg/m L Ginsenoside Rg3、Ginsenoside Rg2、Indole-3-acetic acid、Methyl indole-3-acetate和Senecionine處理的白菜種子萌發(fā)率均顯著下降,分別降低18.33%、8.33%、26.67%、86.67%和23.33%,表明在0.1 mg/m L質(zhì)量濃度下,這5種差異代謝物均能抑制白菜種子萌發(fā)。

表4 白菜種子萌發(fā)率及生長測定(±s)Table 4 Determination of germination rate and growth of cabbage seeds

表4 白菜種子萌發(fā)率及生長測定(±s)Table 4 Determination of germination rate and growth of cabbage seeds

注:不同小寫字母表示處理間在P＜0.05水平存在顯著性差異。Note:Different small letters indicate significant difference among treatments at P＜0.05 level.

指標(biāo)Index質(zhì)量濃度/(mg/m L)Mass concentration對照組CK人參皂苷Rg3 Ginsenoside Rg2人參皂苷Rg2 Ginsenoside Rg3異紫花前胡內(nèi)酯Marmesin金雀花堿Cytisine千里光寧Senecionine吲哚-3-乙酸Indole-3-acetic acid吲哚-3-乙酸甲酯Methyl indole-3-acetate發(fā)芽率/% 0.001 100±0.00 a 98.33±2.89 a 98.33±2.89 a 100±0.00 a 98.33±2.89 a 100±0.00 a 86.67±2.89 b 95.00±5.00 a Germination rate 0.010 98.33±2.89 a 98.33±2.89 a 98.33±2.89 a 100±0.00 a 98.33±2.89 a 90.00±5.00 b 91.67±5.77 a 0.100 91.67±2.89 b 81.67±2.89 b 96.67±2.89 a 96.67±2.89 a 76.67±5.77 b 73.33±7.64 c 13.33±5.77 b根長/cm 0.001 5.17±0.37 a 2.37±0.13 b 3.02±0.31 b 0.63±0.03 c 5.93±0.39 A 3.35±0.18 b 4.08±0.25 b 4.47±0.29 b Root length 0.010 5.36±0.38 a 6.10±0.67 A 2.83±0.16 b 4.97±0.24 a 2.34±0.23 c 4.09±0.08 b 1.76±0.11 c 0.100 0.58±0.05 c 3.71±0.22 b 0.58±0.02 c 3.16±0.22 b 0.65±0.06 d 0.48±0.04 c 0.19±0.04 d莖長/cm 0.001 2.83±0.09 a 2.24±0.08 b 1.83±0.11 b 1.33±0.03 c 2.73±0.07 a 1.86±0.15 b 2.40±0.02 b 2.15±0.10 b Stem length 0.010 2.11±0.20 b 2.54±0.29 a 1.92±0.18 b 2.60±0.11 a 1.20±0.06 b 2.26±0.08 c 1.92±0.02 c 0.100 1.51±0.07 c 1.88±0.07 b 1.05±0.23 c 2.94±0.40 a 1.91±0.17 b 0.86±0.04 d 0.48±0.04 d

與CK組相比,0.001 mg/m L的Cytisine和0.01 mg/m L Ginsenoside Rg3處理能夠促進(jìn)白菜的根長增加,而0.1 mg/m L時,兩種物質(zhì)處理的白菜根長均被顯著抑制,表現(xiàn)出明顯的“低促高抑”現(xiàn)象。除0.01 mg/m L Ginsenoside Rg2無顯著變化外,在3種質(zhì)量濃度下,Ginsenoside Rg2、Indole-3-acetic acid、Methyl indole-3-acetate、Marmesin和Senecionine處理的白菜根長均被顯著抑制,且質(zhì)量濃度為0.1 mg/m L時,抑制效果最明顯。此外,在3種質(zhì)量濃度下,Ginsenoside Rg2、Ginsenoside Rg3、Indole-3-acetic acid、Methyl indole-3-acetate、Marmesin和Senecionine處理的白菜莖長均被顯著抑制,只有0.01 mg/m L Ginsenoside Rg3和Cytisine無 顯 著 變化。以上結(jié)果表明,7種差異代謝物對白菜的生長具有一定的化感抑制作用。

3 討論

植物化感自毒作用是連作障礙產(chǎn)生的主要原因之一。西洋參代謝產(chǎn)物對植株產(chǎn)生的毒害作用可能是連作障礙的主要成因[9],西洋參在生長過程中通過根系向根際土壤中分泌次生代謝產(chǎn)物,這些代謝產(chǎn)物在土壤中不斷積累,最終導(dǎo)致自毒作用的發(fā)生,重茬種植的自毒作用會更加嚴(yán)重。目前,研究發(fā)現(xiàn)這些代謝物質(zhì)會引起土壤理化性質(zhì)變化,進(jìn)而引起微生物群落結(jié)構(gòu)的變化;微生物群落可能會改變根系分泌物的降解并進(jìn)一步影響土壤的理化性質(zhì),土壤性質(zhì)的綜合變化最終導(dǎo)致西洋參根病的發(fā)生[10-11]。連作西洋參根系分泌物、根際土壤微生物群落和土壤理化性質(zhì)之間的作用關(guān)系需要進(jìn)一步研究。要探明西洋參根系分泌物的自毒效應(yīng),首先必須對自毒物質(zhì)進(jìn)行提取分離與鑒定,在這個過程中,化感物質(zhì)的活性會隨著研究技術(shù)和操作過程的不同而變化,采用代謝組學(xué)篩選土壤差異代謝物,實現(xiàn)更全面、無偏性的高覆蓋檢測。

采用LC-MS非靶向代謝組學(xué)技術(shù)對蒸餾水、4 a生西洋參水提液及其根際土浸提液澆灌的西洋參幼苗栽培土進(jìn)行分析,初步篩選出主要差異代謝物44種。這些差異代謝物大多為西洋參的次生代謝產(chǎn)物包括皂苷、生物堿、酮及黃酮、有機酸、萜、醇和香豆素等。通過HPLC對3個處理組的7種差異代謝物Ginsenoside Rg3、Ginsenoside Rg2、Indole-3-acetic acid、Methyl indole-3-acetate、Marmesin、Cytisine和Senecionine的含量進(jìn)行分析,驗證其含量變化,發(fā)現(xiàn)7種差異代謝物含量變化規(guī)律與代謝組學(xué)一致。

正負(fù)離子兩種模式下,皂苷類占比較高,人參皂苷是西洋參的主要次生代謝產(chǎn)物,多積累于西洋參根的韌皮部和周皮部及葉片中[12-13]。西洋參在生長過程中通過根系向根際土壤中分泌少量人參皂苷,在1999年至2002年間的5個不同時間采集加拿大安大略省德里基地的3 a生西洋參根際土壤,發(fā)現(xiàn)土壤人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1和F11的含量為提取土壤干質(zhì)量的0.02%～0.098%,還發(fā)現(xiàn)人參皂苷可以促進(jìn)根莖中腐霉菌的生長,同時抑制拮抗性非致病菌的生長[14]。研究發(fā)現(xiàn),不同濃度的外源人參皂苷混合物及單體皂苷對人參種子萌發(fā)、幼苗根生長及根系抗氧化系統(tǒng)均具有抑制作用[15]。從4 a生西洋參中提取人參總皂苷,發(fā)現(xiàn)不同質(zhì)量濃度(25、50、100 mg/L)人參皂苷粗提液處理后,西洋參幼苗表現(xiàn)出不同程度的低促高抑現(xiàn)象,高濃度處理影響西洋參幼苗根長、根系活力及根尖細(xì)胞的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致西洋參幼苗早期不能正常生長,西洋參的皂苷成分能夠影響自身胚根和幼苗的生長[16-17]。人參總皂苷對人參灰霉菌和人參黑斑菌的生長具有明顯的促進(jìn)作用[18]。3種不同的三萜皂苷單體對三七的種子萌發(fā)和幼苗生長均有不同程度的抑制作用[19]。三七通過殘體腐解、根系分泌向土壤中釋放皂苷等化感物質(zhì)使三七根系組織死亡[20]。當(dāng)?shù)胤N植西洋參多采用和玉米輪作的方式來緩解連作障礙,盧玉秋等[21]采用HPLC檢測玉米根際土壤中19種植物激素含量,測定Indole-3-acetic acid和Methyl indole-3-acetate的含量為1.85 ng/g和0.55 ng/g。本研究中西洋參栽培土壤的Indole-3-acetic acid和Methyl indole-3-acetate含量分別為10.50～16.48μg/g和0.30～1.59 μg/g,其含量較高可能是由于植物種類不同,所產(chǎn)生激素含量不同,也可能是由于西洋參土壤中某些微生物代謝產(chǎn)生,相反,連作西洋參土壤中Indole-3-acetic acid和Methyl indole-3-acetate的積累是否影響土壤微生物群落。從人參栽培土壤中分離出一種名為DCY116T的新型菌株,菌株DCY116T產(chǎn)生Indole-3-acetic acid、鐵載體,并且能夠溶解磷酸鹽作為潛在的植物生長促進(jìn)細(xì)菌[22]。從人參組織中分離出的細(xì)菌內(nèi)生菌具有產(chǎn)生人參皂苷和生物活性代謝物的潛力,人參組織細(xì)菌內(nèi)生菌通過Indole-3-acetic acid和鐵載體產(chǎn)生,具有產(chǎn)生人參皂苷和生物活性代謝物的潛力,對人參的生長產(chǎn)生顯著影響[23]。香豆素類是植物化感物質(zhì)之一,Marmesin是香豆素類化合物,在前胡、當(dāng)歸和草藥隔山香中均檢測到了Marmesin[24]。本研究中,ST組的Marmesin含量顯著高于對照組,且顯著抑制白菜根和莖的生長,可能是西洋參連作障礙發(fā)生的潛在化感自毒物質(zhì)。Cytisine是能夠調(diào)節(jié)植物生長的生物堿。早期研究發(fā)現(xiàn),苦豆草生物堿Cytisine等是一類植物次生代謝物質(zhì),對楊樹生長具一定的促進(jìn)作用。但是其作用與植物激素的作用有一定差異[25-26]。本研究中,ST組Cytisine含量顯著下降,可能因此影響西洋參根的生長,進(jìn)而導(dǎo)致西洋參幼苗死亡率升高。Senecionine為吡咯里西啶類生物堿,是一種天然毒素。本研究中,重茬土浸提液處理組中Senecionine含量顯著高于對照組,且顯著抑制白菜根和莖的生長,0.1 mg/m L時顯著抑制白菜萌發(fā)。本研究中的Indole-3-acetic acid、Methyl indole-3-acetate、Marmesin、Cytisine和Senecionine在植物連作障礙研究中未見報道,后期需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述,西洋參在重茬過程中通過根系分泌等方式導(dǎo)致土壤次生代謝物質(zhì)積累,這些代謝物通過化感作用直接影響西洋參的生長,還會導(dǎo)致土壤理化性質(zhì)和微生物群落改變進(jìn)而影響西洋參的生長,這些差異代謝物可能是導(dǎo)致西洋參連作障礙發(fā)生的潛在化感物質(zhì),研究結(jié)果為西洋參及人參屬的中藥材乃至其他存在連作障礙的作物的相關(guān)研究提供參考。