一株可降解蘋(píng)果廢棄枝條的生防細(xì)菌鑒定

白燕燕,杜文彪,張彥芳,左存武

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,蘭州 730070)

隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式的不斷優(yōu)化和資源的逐步開(kāi)發(fā),生態(tài)環(huán)境受到嚴(yán)重影響。目前中國(guó)以實(shí)施農(nóng)業(yè)清潔生產(chǎn)的方式,實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的清潔化和廢棄物的高效資源化,改變農(nóng)業(yè)生產(chǎn)現(xiàn)狀,防止農(nóng)業(yè)環(huán)境污染,保證農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全。由于蘋(píng)果枝條具有較高的木質(zhì)素而出現(xiàn)木質(zhì)化的現(xiàn)象,所以造成其降解速度緩慢,使果樹(shù)修剪中產(chǎn)生的廢棄枝條容易造成生態(tài)環(huán)境的污染[1],或?qū)е录艨谧躺『2]。

有研究發(fā)現(xiàn)利用纖維素酶對(duì)蘋(píng)果枝條中纖維素類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行降解是最快速、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、有效的途徑[3]。果樹(shù)廢棄枝條中含有大量有機(jī)物和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),通過(guò)纖維素酶降解使這些有效成分能再次被樹(shù)體吸收利用,以減少資源的浪費(fèi)。近年來(lái)蘋(píng)果腐爛病已成為一種嚴(yán)重的果樹(shù)病害,在利用纖維素酶降解枝條的同時(shí)刺激其產(chǎn)生抵抗黑腐皮殼菌的物質(zhì),而這種物質(zhì)在被樹(shù)體吸收后能夠自主產(chǎn)生抵御該病菌的抗性物質(zhì),從根源上減少樹(shù)體病害的發(fā)生,提高果樹(shù)生產(chǎn)率。產(chǎn)纖維素酶菌株主要有細(xì)菌和真菌[4],目前國(guó)內(nèi)外已有關(guān)于利用生防菌降解蘋(píng)果樹(shù)枝條的研究報(bào)道[5],但對(duì)于菌株降解和生防作用的結(jié)合研究較少[6]。

試驗(yàn)初篩選出具有纖維素降解作用的細(xì)菌,測(cè)定該菌株降解纖維素的相關(guān)酶活力及其與黑腐皮殼菌對(duì)峙試驗(yàn)的生防潛力,觀察其形態(tài)特征,并進(jìn)行g(shù)yr A序列的16S r DNA分析鑒定。

1 材料與方法

1.1 菌株的分離純化

1.1.1 試驗(yàn)材料 從甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院天水蘋(píng)果種植試驗(yàn)基地采集顯現(xiàn)降解情況的帶菌枝條,黑腐皮殼菌(Valsa mali)由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供[7]。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 CMC-Na、剛果紅指示劑、3,5-二硝基水楊酸、水楊素等試劑均采購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司。而PremixTaq酶采購(gòu)于北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 體視顯微鏡購(gòu)自卡爾蔡司光學(xué)(中國(guó))有限公司,PCR儀器購(gòu)自德國(guó)耶拿Biometra公司,酶標(biāo)儀購(gòu)自帝肯公司。

1.1.4 供試培養(yǎng)基 CMC剛果紅培養(yǎng)基:(NH4)2SO42 g,MgSO4·7 H2O 0.5 g,KH2PO41 g,NaCl 0.5 g,CMC-Na 20 g,剛果紅0.4 g,瓊脂20 g,蒸餾水0.5 L,p H為7,121℃濕熱滅菌20 min。

LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl 10 g,瓊脂8.35 g。

復(fù)篩培養(yǎng)基:烘干蘋(píng)果枝粉(過(guò)40目篩)40 g,麩皮粉2 g,NaNO33.5 g,NaNO20.14 g,Mn-SO4·H2O 0.42 g,KH2PO41.0 g,FeCl3·H2O 0.023 3 g,瓊脂8 g,水0.5 L,用NaOH調(diào)節(jié)p H為7,121℃濕熱滅菌20 min。

PDA培養(yǎng)基:去皮馬鈴薯200 g,蔗糖20 g,瓊脂20 g,蒸餾水0.5 L,p H為7,121℃濕熱滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基:2 cm枝條500 g,Na NO33.5 g,NaNO20.14 g,MnSO4·H2O 0.42 g,KH2PO41.0 g,FeCl3·H2O 0.023 3 g,瓊脂8 g,水0.5 L。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基:CMC-Na 15 g,酵母粉5 g,KH2PO42 g,p H為7,121℃濕熱滅菌20 min。

1.2 細(xì)菌的初篩和復(fù)篩

初篩采用稀釋涂布法對(duì)帶菌部分枝段進(jìn)行沖刷,進(jìn)行單細(xì)胞分離[8],采用羧甲基剛果紅培養(yǎng)基進(jìn)行初篩[9],篩選出目的菌株。將已分離純化的細(xì)菌接種在CMC-Na剛果紅培養(yǎng)基上,37℃恒溫下培養(yǎng)3 d。若菌株能產(chǎn)生纖維素酶,在培養(yǎng)的菌落邊沿會(huì)出現(xiàn)明顯的透明水解圈。

利用復(fù)篩培養(yǎng)基中接種初篩挑選出的產(chǎn)酶細(xì)菌,37℃條件下培養(yǎng)3 d后觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。通過(guò)以蘋(píng)果枝條為生長(zhǎng)碳源的復(fù)篩培養(yǎng)基的培養(yǎng),復(fù)篩出生長(zhǎng)情況良好的菌以用于后續(xù)對(duì)峙試驗(yàn)及酶活力的測(cè)定。

1.3 細(xì)菌的生防效果鑒定

采用平板對(duì)峙試驗(yàn)測(cè)定篩選獲得菌株的生防效果[10]。將黑腐皮殼菌和復(fù)篩所獲得的細(xì)菌等距離點(diǎn)接在LB培養(yǎng)基平板上,用僅接病原菌的LB平板作對(duì)照(CK),在37℃恒溫條件下培養(yǎng)3 d,觀察是否存在與病原菌的拮抗作用。

1.4 菌株最適生長(zhǎng)特性測(cè)定

將篩選的細(xì)菌在恒定溫度37℃且不同p H(5、6、7、8、9)的條件下和恒定p H=7且不同溫度(25、28、30、32、35、37℃)條件下接種在復(fù)篩培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng),測(cè)定培養(yǎng)4 d后細(xì)菌的菌落直徑。

1.5 產(chǎn)酶活力的測(cè)定

1.5.1 細(xì)菌產(chǎn)酶培養(yǎng) 在復(fù)篩培養(yǎng)基上37℃靜置培養(yǎng)4 d的純化菌落的上下左右,利用打孔器各打5 mm的孔[11],將其接種于裝有50 m L產(chǎn)酶培養(yǎng)基的三角瓶中,37℃、110 r/min振蕩培養(yǎng)2 d用作種子液,在離心機(jī)4℃、12 000 r/min離心10 min除去菌體,所得上清液即為所需酶液[12]。

1.5.2 酶活力的測(cè)定 DNS法酶活力測(cè)定:將1 cm×6 cm的新華一號(hào)定量濾紙條的濃度作為0.5%CMC-Na溶液和0.5%水楊酸苷溶液的反應(yīng)底物,并測(cè)定各溶液的酶活力。對(duì)產(chǎn)酶培養(yǎng)得到粗酶液進(jìn)行DNS反應(yīng)后,用分光光度計(jì)測(cè)定其在540 nm條件下的吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算得在反應(yīng)體系中產(chǎn)生的葡萄糖濃度。在50℃條件下,將葡萄糖產(chǎn)出率為0.001 mg/min所需的酶量定義為一個(gè)纖維素的酶活力單位[13](U/m L)。計(jì)算公式如下:

酶活力單位=5.56×D×G(U·m L-1)

其中,D為反應(yīng)體積的稀釋倍數(shù);G為吸光值對(duì)應(yīng)葡萄糖量(mg)。

1.6 細(xì)菌纖維素降解能力的測(cè)定

將振蕩培養(yǎng)7 d的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中上清液作為種子液。在超凈工作臺(tái)中吸取10 m L種子液將其接種于50 g固體發(fā)酵培養(yǎng)基中,使用滅菌棒攪拌均勻,并使培養(yǎng)基變得濕潤(rùn)。接種后將開(kāi)口密封,在濕度為60%、溫度為37℃的條件下振蕩培養(yǎng)30 d,每間隔一段時(shí)間取出培養(yǎng)的蘋(píng)果枝條段觀察其表面的顏色和腐爛變化。

1.7 基因鑒定

將篩選出的細(xì)菌置于液體LB培養(yǎng)基搖瓶中37℃、110 r/min培養(yǎng)4 d,吸取1 m L上清液,上清液即為DNA模板,進(jìn)行g(shù)yr A序列r DNA 16S區(qū)域PCR擴(kuò)增(PCR條件為:94℃預(yù)變性30 s,98℃變性10 s,58℃退火30 s,72℃延伸120 s,共35個(gè)循環(huán),16℃保存。)、連T載體及挑斑驗(yàn)證送測(cè)。細(xì)菌gyr A序列所用的上、下游引物分別為:5′-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3′和5′-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3′;測(cè)序結(jié)果進(jìn)行NCBI官網(wǎng)BLAST序列比對(duì)。并下載其同源序列后使用軟件MEGA 5.0的領(lǐng)接法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.8 數(shù)據(jù)分析與處理

采用軟件Origin 8.0將圖形可視化,所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用Microsoft Excel 2016進(jìn)行整理并以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離純化和初篩

據(jù)單菌落形態(tài)、大小、顏色、表面光滑度和分布部位的不同,從分離獲得的細(xì)菌中篩選和純化得到具有降解作用的菌株。單皿菌落在瓊脂固體培養(yǎng)基上變成單個(gè)細(xì)胞,再進(jìn)行純化培養(yǎng),將其分別命名為X-1、X-2、X-3。用剛果紅培養(yǎng)基染色細(xì)菌菌落,若菌落被染色則會(huì)出現(xiàn)透明圈。從試驗(yàn)結(jié)果中觀察到,X-2菌落具有更明顯(圖1)的透明圈。根據(jù)出現(xiàn)透明圈的大小,挑選出具有產(chǎn)生纖維素酶的細(xì)菌,有透明圈的細(xì)菌即可初步認(rèn)為其具有降解能力。再連續(xù)培養(yǎng)4 d后分別測(cè)量水解圈直徑(D)和菌落直徑(d),算出3次重復(fù)的平均值。結(jié)果表明,該菌落使用羧甲基剛果紅染色后水解圈直徑為57.25 mm±0.37 mm,菌落直徑為12.81 mm±0.15 mm,D/d的值為4.47(表1)。

圖1 細(xì)菌的生長(zhǎng)情況及染色產(chǎn)生的透明圈Fig.1 Growth of bacteria and transparent circle produced by dyeing

表1 細(xì)菌羧甲基剛果紅染色后的水解圈大小Table 1 Size of transparent circle after carboxymethyl Congo red staining

2.2 細(xì)菌的復(fù)篩

為了進(jìn)一步證明菌株降解蘋(píng)果枝條纖維的能力,采用復(fù)篩培養(yǎng)基對(duì)篩選的降解效果較好的細(xì)菌進(jìn)行再篩。再以蘋(píng)果枝條為生長(zhǎng)碳源的固體復(fù)篩培養(yǎng)基上接種初篩的菌株X-2。結(jié)果表明,菌株X-2在復(fù)篩培養(yǎng)基上生長(zhǎng)效果良好(圖2),培養(yǎng)3 d后菌落潤(rùn)濕,直徑大于8 cm。

圖2 菌株X-2的復(fù)篩Fig.2 Re screening of strain X-2

2.3 細(xì)菌的生防效果鑒定

對(duì)峙實(shí)驗(yàn)中,在復(fù)篩所得菌株與黑腐皮殼菌共同培養(yǎng)后的PAD平板上[14],出現(xiàn)明顯抑菌帶(圖3),表明其對(duì)黑腐皮殼菌生長(zhǎng)具有明顯的拮抗作用。

圖3 菌株X-2對(duì)黑腐皮殼菌生長(zhǎng)的影響情況Fig.3 Growth of Chaetomium nigrum under treatment of strain X-2

2.4 細(xì)菌的生長(zhǎng)特性

在恒定溫度37℃且不同p H(5、6、7、8、9)的固體復(fù)篩培養(yǎng)基上接種菌株X-2[15],靜置培養(yǎng)4 d后測(cè)定菌落直徑并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(圖4)。菌株X-2在p H為8時(shí)菌落直徑最大,為46.32 mm±1.42 mm。結(jié)果表明:菌株X-2為弱堿性菌。

將接種在恒定p H=7且不同的溫度下的菌株X-2于復(fù)篩培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)4 d后,測(cè)定并統(tǒng)計(jì)該菌株菌落的直徑。由圖5可知,菌株X-2在溫度為25～37℃間均可生長(zhǎng),但菌株最適生長(zhǎng)的溫度為30℃,其菌落直徑最大,為36.42 mm±1.35 mm。

綜上,從圖4和圖5分析可得,在溫度為30℃、p H為8時(shí)的條件為菌株X-2的最適生長(zhǎng)條件。

圖4 不同p H下蘋(píng)果枝條纖維降解菌株X-2的生長(zhǎng)狀況Fig.4 Growth of degrading strain X-2 in apple branch fiber under different p H values

圖5 不同溫度下蘋(píng)果枝條纖維降解菌株X-2的生長(zhǎng)狀況Fig.5 Growth status of degrading strain x-2 in apple branches fiber at different temperatures

2.5 菌株的酶活力

以不同葡萄糖濃度(x)為橫坐標(biāo)、吸光度(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=1.083 9x-0.001 1),R2=0.998 9,線性擬合度高。

維素酶對(duì)纖維素的水解功能可被濾紙酶活性替代。測(cè)量菌株酶活力的考察指標(biāo)為濾紙酶活性,與β-葡萄糖苷酶活性共同進(jìn)行菌株X-2酶活力的評(píng)估,而CMCase的酶活力只是作為測(cè)定菌株酶活力的參考指標(biāo)。

將培養(yǎng)4 d后的菌株X-2搖瓶取樣,2 d后取發(fā)酵液,測(cè)定菌株X-2的酶活力。由圖6可知,發(fā)酵培養(yǎng)時(shí),菌株X-2產(chǎn)生的CMCase和β-葡萄糖苷酶的酶活力在第8天均有活力高峰,分別為(8.36±0.02)U/m L和(8.63±0.64)U/m L,濾紙酶在發(fā)酵第10天活力值高達(dá)(12.78±0.03)U/m L。

圖6 蘋(píng)果枝條纖維降解菌株X-2不同培養(yǎng)時(shí)間的酶活力Fig.6 Enzyme activity of degrading strain X-2 in apple branch fiber at different culture time

2.6 細(xì)菌降解枝條的能力

將菌株X-2接種于裝有蘋(píng)果枝條段的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵。起初生長(zhǎng)平緩,由于降解產(chǎn)物的代謝作用,使蘋(píng)果枝條表層組織中的纖維素酶產(chǎn)增多,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也增加。20 d時(shí),枝條皮層開(kāi)始變黑且逐漸降解;30 d時(shí)枝條切口出現(xiàn)裂縫,與發(fā)酵前比較,枝條段表面濕潤(rùn)有菌液且顏色較黑,說(shuō)明蘋(píng)果枝段部分被菌株X-2所降解(圖7)。

圖7 經(jīng)X-2細(xì)菌發(fā)酵降解后的蘋(píng)果枝段Fig.7 Apple branches degraded by X-2 bacteria

枝發(fā)酵培養(yǎng)50 d后,枝條表面更加濕潤(rùn),細(xì)菌粘液增加,以失重法計(jì)算該菌株的枝條發(fā)酵培養(yǎng)降解率為12.36%±0.44%。

2.7 基因鑒定

2.7.1 形態(tài)觀察 將發(fā)酵試驗(yàn)中的菌株X-2移接到LB培養(yǎng)基上,于37℃下培養(yǎng)2 d后觀察到菌株X-2的菌落為淺黃色,不透亮,表面不光滑,有突起,邊緣無(wú)規(guī)則(圖8-A)。在電子顯微鏡下觀察到其形態(tài)呈桿狀,形成的內(nèi)生芽孢為卵形,芽孢兩頭鈍圓,芽孢囊沒(méi)有膨脹,從中生到次端生,具有運(yùn)動(dòng)特性(圖8-B)。

圖8 菌株X-2的菌落形態(tài)及光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)觀察結(jié)果Fig.8 Colony morphology of strain X-2 and morphological observation under optical microscope

2.7.2 16S r DNA基因序列測(cè)定 PCR產(chǎn)物通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),獲得約1 470 bp的DNA片段(圖9)。對(duì)擴(kuò)增出的目的片段測(cè)序后,將得到的序列輸入NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì),再將菌株X-2與基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)中已知16S r DNA序列菌株兩者的最高同源性進(jìn)行對(duì)比,并下載與該細(xì)菌序列相近物種的同源序列,在多序列比對(duì)時(shí)采用Clustal X2,用MEGA 6.0軟件構(gòu)建發(fā)育樹(shù)(圖10)。

圖9 X-2菌株16S r DNA片段擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜(DL 5000 DNA maker)Fig.9 Electrophoretic map of 16S DNA fragment of strain X-2

結(jié)果表明,菌株X-2和解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的16S r DNA序列屬于同一類(lèi),可初步判斷出菌株X-2屬于芽孢桿菌的某一個(gè)亞種。再使用Blast同源序列檢索,可以分析得出菌株X-2與解淀粉芽孢桿菌的親緣關(guān)系接近。由圖10可知,序列同源性為99%以上,可得出該生防菌株X-2為解淀粉芽孢桿菌。

圖10 X-2菌株基于16S r DNA序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.10 Phylogenetic tree of strain X-2 based on 16S r DNA sequence

3 討論

纖維素的降解主要是憑借微生物自身產(chǎn)生的纖維素酶起作用[16],本試驗(yàn)主要以濾紙條作為反應(yīng)底物,通過(guò)測(cè)定濾紙酶[17]、β-葡萄糖苷酶和CMC酶3種酶配合協(xié)作后的總酶活力來(lái)表示纖維素的酶活力[18]。現(xiàn)對(duì)解淀粉芽孢桿菌纖維素降解活性的研究較多。劉宇等[19]研究測(cè)得濾紙酶的活力為8.35 U/m L,β-葡萄糖苷酶的活力為2.3 U/m L,而在本試驗(yàn)中測(cè)得菌株X-2濾紙酶活力和β-葡萄糖苷酶活力高達(dá)(12.78±0.03)U/m L和(8.63±0.64)U/m L。景如賢等[20]測(cè)得CMCase酶活力為1.46 U/m L,而在本研究中CMCase酶活力約為(8.36±0.02)U/m L,菌株X-2產(chǎn)纖維素酶的效果相對(duì)于其他菌株的較好,且各酶的活力均比前人研究中的酶活力高,這表明該菌株對(duì)蘋(píng)果廢棄枝條的纖維素降解效果良好。

本研究結(jié)果表明,解淀粉芽孢桿菌可在降解過(guò)程中抑制廢棄枝條中腐爛病的發(fā)生,也能夠誘導(dǎo)樹(shù)體產(chǎn)生抗性,激發(fā)植物的抗性反應(yīng),進(jìn)一步增加樹(shù)體從根源上抵御蘋(píng)果腐爛病菌的能力。