嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白含量測定方法的研究

聶曉臻， 孫 潔， 王 倩， 俞方璐

中檢科(上海)測試技術有限公司,上海 201206

乳鐵蛋白是一種天然的、具有免疫功能的球狀單體糖蛋白，屬于轉鐵蛋白家族的一員。乳鐵蛋白具有殺菌和抑菌、抗病毒、抗氧化、免疫調節、調整腸道菌群、促進鐵吸收等功能[1]。嬰幼兒配方食品成分復雜，其中脂肪、碳水化合物、蛋白質含量高，而乳鐵蛋白含量低，常見乳粉添加量在20 mg/100 g～50 mg/100 g左右，在檢測過程中，各種雜蛋白干擾大。目前，國家尚未制定檢測嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白含量測定的標準方法。因乳鐵蛋白未進入檢測體系，年度食品安全監督抽檢并未包含該項檢測，將會影響業界對嬰幼兒配方食品質量的判定，不利于嬰幼兒配方食品中營養強化添加劑的風險監督監測。因此，我國急需對嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白的檢測方法進行探究，完善我國食品安全管控體系。所以本研究從國家標準、行業標準等乳制品檢測方法中選出5種蛋白質沉淀前處理過程，比較分離蛋白質后，乳鐵蛋白的測定結果，為日常檢測乳鐵蛋白提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

乳鐵蛋白標準品，Glycarbo；乙腈(色譜純)，上海安譜實驗科技股份有限公司；氯化鈉、磷酸、十二水合磷酸氫二鈉、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、鹽酸、氫氧化鈉、三氯乙酸(分析級)，上海凌峰化學試劑有限公司。

1.2 儀器

U3000高效液相色譜儀，配備紫外檢測器(VWD)(美國賽默飛世爾科技有限公司)；HiTrap Heparin HP(1 mL)肝素親和柱(美國GE Healthcare)；電子天平(賽多利斯)；超聲清洗儀(昆山舒美)；渦旋混合器(大龍)；pH計(賽多利斯)。

1.3 溶液的配制

磷酸氫二鈉溶液(0.5 mol/L)：稱取17.9 g十二水合磷酸氫二鈉，加適量水溶解，用磷酸調節pH至7.00±0.05，加水定容至1 L。

磷酸氫二鈉(0.5 mol/L)-氯化鈉溶液(1.0 mol/L)：稱取17.9 g十二水合磷酸氫二鈉，58.4 g氯化鈉，加適量水溶解，用磷酸調節pH至7.00±0.05，加水定容至1 L。

亞鐵氰化鉀溶液：稱取15.0 g亞鐵氰化鉀，用水溶解并定容至100 mL。

乙酸鋅溶液：稱取30.0 g乙酸鋅，用水溶解并定容至100 mL。

鹽酸溶液(1 mol/L)：吸取83 mL鹽酸，于1 L燒杯中，加917 mL水，混勻。

氫氧化鈉溶液(1 mol/L)：稱取40 g氫氧化鈉于1 L燒杯中，加水溶解并稀釋至1 L，混勻。

三氯乙酸溶液(150 g/L)：稱取15.0 g三氯乙酸，加水溶解并稀釋至100 mL，混勻。

實驗室用水為Milli-Q超純水。

1.4 標準溶液的配制

乳鐵蛋白標準儲備液(1.0 mg/mL): 稱量按證書提供的純度(98%)，準確稱取乳鐵蛋白標準品10.20 mg，用超純水溶解，定容至10 mL，置于4 ℃冰箱中保存。

乳鐵蛋白標準工作溶液：分別準確吸取乳鐵蛋白標準儲備液，用磷酸氫二鈉溶液逐級稀釋成濃度為10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL的標準曲線工作液。

1.5 樣品處理方法

稱取5 g樣品于50 mL燒杯中，加入20 mL水，渦旋混勻后待處理。含淀粉類樣品(如米粉、面條等)，再加入0.5 g淀粉酶，于37 ℃水浴鍋中酶解30 min后取出，冷卻備用。

1.5.1磷酸沉淀過程[2]

用磷酸調節pH至4.6±0.1，轉移至50 mL容器瓶中，用水定容至刻度，混勻，靜置30 min后濾紙過濾，濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾至液相色譜進樣瓶中，上機測定。

1.5.2三氯乙酸沉淀過程[3]

將樣品溶液轉移至50 mL容器瓶中，用三氯乙酸溶液定容至50 mL，靜置5 min后濾紙過濾，濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾至液相色譜進樣瓶中，上機測定。

1.5.3乙腈沉淀過程[4]

將樣品溶液轉移至50 mL容器瓶中，用乙腈定容至50 mL，混勻后靜置10 min，濾紙過濾，濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾至液相色譜進樣瓶中，上機測定。

1.5.4沉淀劑沉淀過程[5]

加入1.0 mL亞鐵氰化鉀溶液，渦旋混勻，再加入1.0 mL乙酸鋅溶液，渦旋混勻，轉移至50 mL容器瓶中用水定容至刻度，靜置10 min，濾紙過濾，濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾至液相色譜進樣瓶中，上機測定。

1.5.5等電點沉淀過程[6]

用1.0 mol/L鹽酸溶液調節試樣溶液的pH至1.7±0.1，靜置2 min后，再用1.0 mol/L氫氧化鈉溶液調節試樣溶液的pH至4.5±0.1，置于水浴超聲15 min，充分提取后轉移至50 mL容量瓶中用水定容至刻度，混勻后濾紙過濾，濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾至液相色譜進樣瓶中，上機測定。

1.6 液相色譜上機條件

色譜柱：HiTrap Heparin肝素親和柱；柱溫：30 ℃；進樣量：50 μL；檢測波長：280 nm；流速：1.0 mL/min；流動相A：磷酸氫二鈉溶液；流動相B：磷酸氫二鈉-氯化鈉溶液。

2 結果與討論

2.1 乳鐵蛋白標準曲線

乳鐵蛋白的線性變化范圍為：10 μg/mL ～200 μg/mL，線性回歸方程為Y=0.167 9X-1.063 4，相關系數0.999 5。見圖1和圖2。

圖1 乳鐵蛋白標準溶液色譜圖

圖2 乳鐵蛋白標準曲線

2.2 不同沉淀方法的加標回收率比較

在廠家提供的空白乳基奶粉中添加3 mg/100 g、20 mg/100 g和50 mg/100 g的乳鐵蛋白，用1.5中提到的5種方法進行加標回收試驗，分別進行六平行試樣，表1為不同沉淀方法的乳鐵蛋白加標回收率數據比較，色譜圖見圖3～圖7。

表1 不同沉淀方法的乳鐵蛋白加標回收率數據比較

圖3 磷酸沉淀法加標樣品色譜圖

圖4 三氯乙酸沉淀法加標樣品色譜圖

圖5 乙腈沉淀法加標樣品色譜圖

圖6 沉淀劑沉淀法加標樣品色譜圖

圖7 等電點沉淀法加標樣品色譜圖

磷酸調節pH沉淀法的加標回收率在95.7%～102%之間，三氯乙酸沉淀法、有機試劑(乙腈)沉淀法、沉淀劑(亞鐵氰化鉀乙酸鋅)沉淀法結果均未檢出。等電點沉淀法回收率結果偏低，因此選擇磷酸沉淀法。

2.3 檢出限與定量限

在空白樣品中添加低濃度的乳鐵蛋白標準溶液，通過對儀器信噪比進行分析，以信噪比約為3和10進行評定檢出限和定量限。本方法中乳鐵蛋白的方法檢出限為1 mg/100 g，定量限為3 mg/100 g。

2.4 不同基質對乳鐵蛋白檢測的影響

在市售產品中挑選了豆基奶粉、部分蛋白水解配方食品和米粉，向其添加1 mg/100 g、20 mg/100 g和50 mg/100 g的乳鐵蛋白，經過磷酸沉淀處理上機，做六次平行實驗，表2為不同基質下乳鐵蛋白加標回收率數據比較。

從加標回收率可以看出，該方法同時適用于豆基奶粉和米粉，但不適用于部分蛋白水解食品。

2.5 實際樣品檢測

隨機抽取市面上常見的額外添加乳鐵蛋白的嬰幼兒配方乳粉，經過磷酸沉淀處理上機，檢測結果見表3。

表2 不同基質下乳鐵蛋白加標回收率數據比較

表3 乳鐵蛋白測定結果表

檢測結果表明，以上7種嬰幼兒配方乳粉的乳鐵蛋白標簽值與實測值一致。

3 結論

本實驗比較了5種分離蛋白質的方法對嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白的測定結果的影響，其中，磷酸調節pH沉淀法的加標回收率在85%～105%之間，精密度在10%以內，且準確度高、穩定性好，但不適用于特殊醫學用途部分蛋白水解食品。三氯乙酸沉淀法、有機試劑(乙腈)沉淀法、沉淀劑(亞鐵氰化鉀乙酸鋅)沉淀法結果均未檢出。等電點沉淀法結果偏低，準確度低，不適用于嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白的檢測。