天然植物當歸中藁本內酯含量測定方法的建立

仝文科， 杜紅娜★，朱明月 ，聶曉博 ，張延華 ，崔克爭，孔素葉

（1.中農翎翔河北生物科技有限公司，河北行唐 050699；2.石家莊醫學高等專科學校，河北靈壽 050200；3.行唐縣動物衛生監督所，河北行唐 050699；4.行唐縣畜牧局動物疫病預防控制中心，河北行唐 050699）

當歸為傘形科植物當歸Angelicasinensis（Oliv.）Diels 的干燥根， 作為117 種藥食同源的可飼用天然植物被列入《飼料原料目錄》。 當歸是補血圣藥，素有“十方九歸”之稱。 隨著畜牧業快速發展，具有綠色、安全、環保優勢的天然植物被廣泛應用于臨床， 天然植物的應用必將引領我國畜牧業向綠色生態方向發展。 目前，關于天然植物的研究也越來越多， 現代藥理學研究發現，當歸對畜禽機體血液系統、免疫系統等均具有顯著的藥理作用。 現代研究表明，當歸傳統功效的物質基礎主要是揮發性成分、有機酸類、多糖類等，當歸中揮發油主要成分為藁本內酯、正丁烯基內酯、當歸酮、香荊芥酚等[1，2]。 目前，藥典“當歸”飲片項下只有阿魏酸含量測定方法，沒有對藁本內酯進行含量規定。 因此，為了控制天然植物當歸中藁本內酯的含量，因此，本研究擬建立一種準確可靠的當歸中藁本內酯含量測定方法， 為當歸飲片中藁本內酯的含量測定提供可借鑒的方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters e2695-2998 （美國） 高效液相色譜儀。

Symmetry C18（5 微米，250 毫米×4.6 毫米）色譜柱；e2695 泵，Empower3 數據處理軟件系統；2998 PDA 檢測器。

1.2 藥物與試劑

藁本內酯對照品 （上海純優生物科技有限公司，供含量測定用，含量以98%計）。 甲醇：色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.3 藥材

當歸藥材購于安國藥材市場， 經本公司質控部鑒定符合《中華人民共和國獸藥典》2020 版（Ⅱ部）項下有關規定[1]。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Sy 毫米etry C18 （5 微米，250 毫米×4.6 毫米），C18 預柱。 流動相：甲醇-0.5%醋酸（65：35）。流速：1.0 毫升/分鐘。柱溫：30℃。 檢測波長：324 納米。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取藁本內酯約10 毫克， 置10 毫升量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液 （藁本內酯對照品貯備液的濃度為1.12 毫克/毫升）。 色譜圖見圖1。

圖1 藁本內酯對照品高效液相色譜圖

2.3 線性范圍的考察

分別精密量取藁本內酯對照品貯備液（1.12毫克/毫升）0.5 毫升， 三份， 分別置25 毫升、50毫升、100 毫升量瓶中； 分別精密量取藁本內酯對照品貯備液1.0 毫升，三份，分別置5 毫升、10毫升、25 毫升量瓶中；精密量取藁本內酯對照品貯備液2 毫升置5 毫升量瓶中，上述樣品，均加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。各進樣10 微升，記錄色譜圖，分別測定峰面積值，結果見表1。 并以峰面積值（y）對樣品濃度（x）進行線性回歸，得標準曲線方程：

表1 藁本內酯對照品峰面積測定結果

y =15668678.93 x-1373.53，r = 1.0000

以峰面積值（y）-樣品濃度（x）作圖，得一直線（見圖2）。 試驗結果表明：在0.006～0.480 毫克/毫升范圍內， 藁本內酯的峰面積值與樣品濃度有良好的線性關系（見表1）。

圖2 標準曲線圖

2.4 供試品溶液的制備

2.4.1 提取方式考察

超聲提取法： 取本品粉末 （過三號篩）0.5克，精密稱定，置100 毫升具塞錐形瓶中，加甲醇50 毫升，超聲提取40 分鐘，過濾，濾液用甲醇定容至100 毫升量瓶，即得；

回流提取法： 取本品粉末 （過三號篩）0.5克，精密稱定，置100 毫升具塞錐形瓶中，加甲醇50 毫升，加熱回流提取1 小時，過濾，濾液用甲醇定容至100 毫升量瓶，即得；

索氏提取法： 取本品粉末 （過三號篩）0.5克，精密稱定，置100 毫升具塞錐形瓶中，加甲醇適量，索提4 小時后，放冷，定容至100 毫升量瓶，即得。

將定容后三份樣品搖勻，濾過，取續濾液進樣，分別測定含量，結果見表2。

表2 不同提取方法的比較（n=2）

結果表明， 索氏提取法藁本內酯含量相對較高，但是三種方法差異較小，因超聲提取方法簡捷易行，故確定提取方式為超聲提取法。

2.4.2 提取溶媒考察

取本品粉末（過三號篩）0.5 克，精密稱定，置100 毫升具塞錐形瓶中，分別加入不同的提取溶媒50 毫升，稱定重量，超聲提取40 分鐘，提取液放冷后稱定重量， 用提取溶媒補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液進樣，分別測定含量，結果見表3。

表3 不同溶媒提取的比較（n=2）

以上結果表明， 甲醇所測定的藁本內酯含量大，故確定選擇甲醇作為最佳提取溶媒。

2.4.3 提取溶媒用量考察

取本品粉末（過三號篩）0.5 克，精密稱定，置100 毫升具塞錐形瓶中，分別加入不同量的甲醇，稱定重量，超聲提取40 分鐘，提取液放冷后稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液進樣，分別測定含量，結果見表4。

表4 不同溶媒用量提取的比較（n=2）

為保證提取完全，選取50 毫升作為最佳提取溶媒用量。

2.4.4 提取時間考察

取本品粉末（過三號篩）0.5 克，精密稱定，置100 毫升具塞錐形瓶中，加甲醇50 毫升，稱定重量，分別超聲處理不同時間，放冷后用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液進樣，分別測定含量，結果見表5。

表5 不同超聲處理時間的比較（n=2）

以上結果表明，超聲處理40～60 分鐘，可提取完全，為節省時間成本，確定最佳超聲處理時間為40 分鐘。

2.4.5 供試品溶液色譜圖

取本品粉末（過三號篩）0.5 克，精密稱定，置100 毫升具塞錐形瓶中，加甲醇50 毫升，稱定重量，超聲處理40 分鐘，放冷后用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液進樣，色譜圖見圖3。

圖3 當歸供試品溶液高效液相色譜圖

2.5 方法學考察

2.5.1 重復性考察

按取樣量0.8∶1.0∶1.2 的比例分別稱取樣品，各平行三份，稱定，按已確定的方法制備供試品溶液，測定峰面積值并計算藁本內酯含量。 試驗結果表明， 藁本內酯平均含量為8.00 毫克/克，RSD 值 為 1.24% ，RSD ＜2%，該方法重復性良好。

2.5.2 精密度考察

取對照品溶液及重復性考察項下的供試品溶液各10 微升， 重復進樣6 次，試驗結果表明，對照品和供試品溶液藁本內酯面積值的RSD 值分別為0.24%和0.29%，RSD＜2%，該方法精密度良好。

2.5.3 穩定性考察

按已確定的方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24、36 及48小時，分別進樣10 微升， 試驗結果表明，樣品中藁本內酯峰面積值的RSD值 為 0.31% ，RSD＜2%，供試品溶液在48 小時內穩定性良好。

2.5.4 回收率考察

設計三個不同濃度的對照品溶液，取已知含量的樣品約0.25 克，分別精密加入高、中、低三個濃度的藁本內酯對照品溶液50 毫升， 每個濃度分別制備3 份供試品溶液進行測定，按確定的供試品溶液和色譜條件，分別制備加樣回收供試品溶液并注入高效液相色譜儀，以下列公式計算回收率，結果見表6。

表6 回收率考察結果（n=3）

試驗結果表明： 藁本內酯回收率在98%～102%，平均回收率為99.98%，RSD 值為1.35%，RSD＜2%，加樣回收良好。

3 討論

藁本內酯為當歸揮發油的主要活性成分，故選擇藁本內酯作為控制當歸質量的指標性成分，本研究參照有關文獻[3-7]，建立高效液相色譜法測定當歸中藁本內酯含量。 在研究過程中，對供試品溶液制備方法進行考察，對提取方式（超聲提取法、回流提取法、索氏提取法）、提取溶媒（水、50%甲醇、70%甲醇、甲醇、95%乙醇）、提取溶媒用量（20 毫升、50 毫升、100 毫升）和提取時間（20 分鐘、30 分鐘、40 分鐘、50 分鐘、60 分鐘）進行考察， 在保證藁本內酯提取完全的情況下，綜合考慮成本， 確定最佳提取方式為超聲提取，提取溶媒為甲醇，溶媒用量為50 毫升，提取時間40 分鐘。

南海軍等[8]采用氣相色譜測定了不同產地當歸藥材中藁本內酯的含量，結果顯示甘肅產當歸中藁本內酯的含量較高。 本研究，對當歸道地藥材種植區域（甘肅岷縣、甘肅漳縣）進行樣品采集，包括新鮮樣品及陳當歸樣品的采集，含量測定結果顯示，道地藥材中藁本內酯含量在13～22毫克/克， 新鮮當歸藥材中藁本內酯的含量要高于陳當歸藥材中的含量，而且藁本內酯的含量隨著時間有所下降。

經多次試驗驗證， 高效液相色譜測定當歸中藁本內酯含量的方法，分離效果好、靈敏度高、重復性好，準確度高，適用于天然植物當歸中藁本內酯含量的測定。該方法可為藥典“當歸”飲片項下藁本內酯質量控制提供參考，以便更好地控制當歸飲片質量，為畜禽產品提供更好的質量保障，為畜牧行業保駕護航。

（基金項目：石家莊市技術創新中心項目（中心名稱： 石家莊市天然植物飼料添加劑技術創新中心）