circ_RNF111靶向miRNA-361-5p 對非小細胞肺癌細胞增殖和凋亡能力的影響

賈永，閻鵬，王榕#

1寶雞市中心醫院胸外科，陜西 寶雞 721000

2寶雞高新醫院腫瘤內科，陜西 寶雞 721000

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）確診時多已進展至晚期，預后較差，深入研究NSCLC的致病機制對預防和治療肺癌是非常重要的，隨著分子生物學和基因組學的發展，開啟了NSCLC的靶向精準治療時代[1-2]。研究顯示，RNF111基因啟動子區甲基化與NSCLC的轉移有關[3]。circ_RNF111通過與miRNA-27b-3p結合來促進胃癌細胞的生長和侵襲[4]。但目前尚無circ_RNF111與NSCLC關系的相關報道。微小RNA（microRNA，miRNA）參與調控了肺癌進展的多個過程，是肺癌精準醫學預測和患者預后的腫瘤標志物[5]。研究報道，miRNA-361-5p在NSCLC中低表達，與TNM分期、淋巴結轉移和淋巴浸潤明顯相關[6]。miRNA-361-5p過表達能夠抑制NSCLC細胞H23的增殖和集落形成能力[7]。生物學軟件預測發現circ_RNF111與miRNA-361-5p有結合位點。因此，本研究旨在探討circ_RNF111是否能夠通過調控miRNA-361-5p影響NSCLC進展，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月至2021年6月寶雞市中心醫院收治的NSCLC患者。納入標準：①病理檢查確診為NSCLC；②未進行過放化療。排除標準：①合并其他惡性腫瘤、重大系統疾病、全身感染；③存在明顯腫瘤轉移。依據納入和排除標準，本研究共納入80例NSCLC患者，其中男48例，女32例；年齡39～78歲，平均（58.64±6.65）；分化程度：低分化30例，中高分化50例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期34例，Ⅲ～Ⅳ期46例；病理類型：腺癌37例，鱗狀細胞癌23例，大細胞未分化癌6例，腺鱗癌5例，其他9例。取80例NSCLC患者的腫瘤組織及相應癌旁組織，置于液氮中冷凍保存，采用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢 測circ_RNF111和miRNA-361-5p的相對表達量。本研究經醫院倫理委員會批準通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞、主要試劑和儀器 人肺癌A549細胞購自美國ATCC公司。噻唑藍（methyl thiazolyl terazolium，MTT）試劑盒、凋亡檢測試劑盒均購自北京百奧萊博科技有限公司，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國AAT Bioquest公司，熒光定量PCR試劑盒、Trizol試劑、逆轉錄試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2.2 細胞培養和分組 采用RPMI-1640培養基常規培養人肺癌A549細胞，將si-NC、sicirc_RNF111、miRNA-NC、miRNA-361-5p mimic分別轉染至A549細胞，分別作為si-NC組、sicirc_RNF111組、miRNA-NC組、miRNA-361-5p mimic組；將si-circ_RNF111分別與anti-miRNANC、miRNA-361-5p inhibitor共轉染至A549細胞，分別作為si-circ_RNF111+anti-miRNA-NC組、sicirc_RNF111+miRNA-361-5p inhibitor組。

1.2.3 qRT-PCR法檢測circ_RNF111和miRNA-361-5p 的相對表達量 取80例NSCLC患者的腫瘤組織、癌旁組織及各組人肺癌A549細胞，提取總RNA，合成互補DNA（complementary DNA，cDNA）后進行 PCR，反應體系：上下游引物各 0.4 μl，2 μl的cDNA，2.5 μl的10×緩沖液，2.5 μl的脫氧核糖核苷三磷酸，加無酶超純水至20 μl；反應條件：95℃預變性15 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火/延伸32 s，共計40個循環。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）和U6為內參，采用 2-△△Ct法計算 circ_RNF111 和 miRNA-361-5p的相對表達量。circ_RNF111上游引物5'-TCCAGAGCAACGTACC-3'，下 游 引 物 5'-ATGGACGAACGTAGA-3'；miRNA-361-5p 上游引物5'-CGTGATTGCAACTAT-3'，下 游 引 物 5'-GAAACGTTCAGCTTGT-3'；GAPDH上游引物5'-GCCATTGCAACGTATATT-3'，下游引物 5'-AAGCCCTAGGTACAATT-3'；U6 上 游 引 物 5'-ATTGACACTTAGGACCATC-3'，下 游 引 物 5'-GAAATCGGGCAGGTAC-3'。

1.2.4 雙熒光素酶報告實驗 將circ_RNF111野生型熒光素酶載體（WT-circ_RNF111）和突變型熒光素酶載體（MUT-circ_RNF111）分別與miRNA-NC和miRNA-361-5p共轉染至人肺癌A549細胞中，分別作為miRNA-NC組和miRNA-361-5p組，轉染48 h后檢測人肺癌A549細胞熒光素酶的相對表達量。此外，探討抑制circ_RNF111的表達對miRNA-361-5p表達的調控作用，比較si-NC組與sicirc_RNF111組 circ_RNF111、miRNA-361-5p的相對表達量。

1.2.5 MTT 法檢測細胞增殖情況 取各組人肺癌A549細胞以5×103/孔接種到96孔板，培養48 h后更換為含20%MTT溶液的培養液，繼續培養4 h，加入150 μl二甲基亞砜振蕩反應15 min。采用酶標儀檢測490 nm處光密度（optical density，OD）值，計算細胞增殖抑制率。

1.2.6 克隆形成實驗檢測細胞集落形成數 取各組人肺癌A549細胞以100/孔接種于6孔板中，培養2周，甲醇固定細胞集落15 min，結晶紫染色30 min，在低倍光學顯微鏡下計數細胞＞50的集落。

1.2.7 流式細胞術檢測細胞凋亡情況 取各組人肺癌A549細胞，用預冷磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）漂洗 2次，加入 500 μl結合緩沖液混勻；分別用膜聯蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）進行避光染色，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件對所有數據進-行統計分析，正態分布計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，采用Pearson相關分析法進行相關分析；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 circ_RNF111和miRNA-361-5p 的相對表達量及相關性

NSCLC患者腫瘤組織中circ_RNF111的相對表達量明顯高于癌旁組織，miRNA-361-5p的相對表達量明顯低于癌旁組織，差異均有統計學意義（P＜0.01）（表1）。Pearson相關分析顯示，腫瘤組織中circ_RNF111與miRNA-361-5p的表達呈負相關（r=-0.949，P＜0.05）。

表1 NSCLC患者腫瘤組織和癌旁組織中-circ_RNF111和miRNA-361-5p相對表達量的比較（±s）

表1 NSCLC患者腫瘤組織和癌旁組織中-circ_RNF111和miRNA-361-5p相對表達量的比較（±s）

組織癌旁組織（n=8 0）腫瘤組織（n=8 0）t值P值0.7 8±0.1 6 2.1 8±0.3 3 3 4.1 4 4 0.0 0 0 1.0 7±0.1 6 0.4 8±0.1 0 2 7.9 6 9 0.0 0 0 c i r c_R N F 1 1 1 m i R N A-3 6 1-5 p

2.2 不同臨床特征NSCLC 患者腫瘤組織中circ_RNF111、miRNA-361-5p相對表達量的比較

不同年齡、分化程度NSCLC患者腫瘤組織中circ_RNF111、miRNA-361-5p相對表達量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期的NSCLC患者腫瘤組織中circ_RNF111相對表達量明顯高于Ⅰ～Ⅱ期患者，miRNA-361-5p相對表達量明顯低于Ⅰ～Ⅱ期患者，差異均有統計學意義（t=14.343、7.536，P＜0.01）。（表2）

表2 不同臨床特征NSCLC患者腫瘤組織中circ_RNF111、miRNA-361-5p的相對表達量

2.3 circ_RNF111和miRNA-361-5p靶向關系的驗證

miRNA-361-5p組細胞WT-circ_RNF111相對表達量明顯低于miRNA-NC組，差異有統計學意義（P＜0.05）；miRNA-NC組與miRNA-361-5p組細胞MUT-circ_RNF111相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。si-circ_RNF111組circ_RNF111相對表達量明顯低于si-NC組，miRNA-361-5p相對表達量明顯高于si-NC組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表3、表4、圖1）

圖1 circ_RNF111與miRNA-361-5p互補序列

表3 雙熒光素酶報告實驗檢測人肺癌A549細胞WT-circ_RNF111和MUT-circ_RNF111的相對表達量（±s）

表3 雙熒光素酶報告實驗檢測人肺癌A549細胞WT-circ_RNF111和MUT-circ_RNF111的相對表達量（±s）

組別m i R N A-N C組m i R N A-3 6 1-5 p組t值P值1.0 1±0.0 7 0.4 4±0.0 4 2 1.2 1 0 0.0 0 0 0.9 7±0.0 9 1.0 0±0.0 7 0.7 8 9 0.4 4 1 W T-c i r c_R N F 1 1 1 M U T-c i r c_R N F 1 1 1

表4 抑制circ_RNF111的表達對miRNA-361-5p表達的影響（±s）

表4 抑制circ_RNF111的表達對miRNA-361-5p表達的影響（±s）

組別si-NC組si-circ_RNF111組t值P值circ_RNF111 1.00±0.00 0.29±0.03 71.000 0.000 miRNA-361-5p 1.00±0.00 4.60±0.13 83.077 0.000

2.4 circ_RNF111、miRNA-361-5p對人肺癌A549細胞增殖能力的影響

si-circ_RNF111組細胞增殖抑制率高于si-NC組，集落形成數低于si-NC組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；miRNA-361-5p mimic組細胞增殖抑制率高于miRNA-NC組，集落形成數低于miRNANC組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；sicirc_RNF111+miRNA-361-5p inhibitor組A549細胞增殖抑制率低于si-circ_RNF111+anti-miRNA-NC組，集落形成數高于si-circ_RNF111+anti-miRNANC組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表5）

表5 circ_RNF111、miRNA-361-5p對人-肺癌A549細胞增殖抑制率和集落形成數的影響（±s）

表5 circ_RNF111、miRNA-361-5p對人-肺癌A549細胞增殖抑制率和集落形成數的影響（±s）

注：a與si-NC組比較，P＜0.05；b與miRNA-NC組比較，P＜0.05；c與sicirc_RNF111+anti-miRNA-NC組比較，P＜0.05

組別s i-N C組s i-c i r c_R N F 1 1 1組m i R N A-N C組m i R N A-3 6 1-5 p m i m i c組s i-c i r c_R N F 1 1 1+a n t i-m i R N A-N C組s i-c i r c_R N F 1 1 1+m i R N A-3 6 1-5 p i n h i b i t o r組F值P值0.0 0±0.0 0 5 5.2 1±2.3 4 a 0.0 4±0.0 3 4 6.0 4±2.3 8 b 5 5.4 2±1.5 0 1 9.9 3±1.1 3 c 2 5 2 9.6 1 0 0.0 0 0 1 2 0.6 7±6.8 0 5 5.2 2±2.1 5 a 1 1 8.4 4±1 0.5 4 6 7.8 9±3.3 8 b 5 4.1 1±2.3 3 9 9.7 8±6.0 7 c 2 3 7.2 1 2 0.0 0 0增殖抑制率（%）集落形成數

2.5 circ_RNF111、miRNA-361-5p對人肺癌A549細胞凋亡能力的影響

si-circ_RNF111組細胞凋亡率高于si-NC組，miRNA-361-5p mimic組細胞凋亡率高于miRNANC組，si-circ_RNF111+miRNA-361-5p inhibitor組細胞凋亡率低于si-circ_RNF111+anti-miRNA-NC組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表6、圖2）

圖2 流式細胞儀檢測人肺癌A549細胞凋亡情況

表6 circ_RNF111、miRN-A-361-5p對人肺癌A549細胞凋亡能力的影響（%，±s）

表6 circ_RNF111、miRN-A-361-5p對人肺癌A549細胞凋亡能力的影響（%，±s）

注：a與si-NC組比較，P＜0.05；b與miRNA-NC組比較，P＜0.05；c與sicirc_RNF111+anti-miRNA-NC組比較，P＜0.05

組別si-NC組si-circ_RNF111組miRNA-NC組miRNA-361-5p mimic組si-circ_RNF111+anti-miRNA-NC組si-circ_RNF111+miRNA-361-5p inhibitor組F值P值細胞凋亡率7.68±0.65 22.53±1.19a 7.77±0.56 19.66±1.09b 22.25±1.24 12.22±0.77c 481.331 0.000

3 討論

NSCLC是目前最常見的惡性腫瘤，隨著細胞和分子生物技術的迅速發展，研發出了以關鍵基因和調控分子為靶點的靶向治療藥物，非編碼RNA可作為分子靶向治療的靶點[8-9]。研究表明，環狀RNA（circular RNA，circRNA）-miRNA-信使 RNA（messenger RNA，mRNA）可調控NSCLC的發生發展[10]，如circRNA_102179可通過調控miRNA-330-5p/高遷移率族蛋白3（high-mobility group box 3，HMG3）信號通路促進NSCLC細胞的增殖、遷移和侵襲[11]。敲低circRNA_CDR1as的表達可通過調節miRNA-219a-5p/性別決定區Y框蛋白5（sex determining region Y-box 5，SOX5）信號通路抑制NSCLC的發生發展[12]。研究顯示，circ_RNF111高表達于胃癌組織和細胞中，敲低circ-RNF111的表達可抑制胃癌細胞增殖、遷移、侵襲和集落形成能力，并誘導細胞凋亡[13]，但circ_RNF111對NSCLC細胞的影響及具體機制尚不清楚。本研究結果顯示，NSCLC患者腫瘤組織中circ_RNF111的相對表達量明顯高于癌旁組織，且臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期的NSCLC患者腫瘤組織中circ_RNF111的相對表達量明顯高于Ⅰ～Ⅱ期患者，表明circ_RNF111可能參與NSCLC的進展。進一步干擾circ_RNF111的表達導致A549細胞凋亡率和增殖抑制率升高、集落形成數減少，表明干擾circ_RNF111的表達可抑制NSCLC細胞的增殖，并促進其凋亡。

研究顯示，miRNA-361-5p過表達通過調節SMAD2來誘導人肺腺癌A549細胞凋亡[14]。miRNA-361-5p過表達通過靶向叉頭框蛋白M1（forkhead box M1，FOXM1）來抑制肺癌細胞的增殖和侵襲[15]。本研究結果顯示，NSCLC患者腫瘤組織中miRNA-361-5p的相對表達量明顯低于癌旁組織，且可能與NSCLC患者的TNM分期有關，與Zhuang等[6]的研究結果相符。過表達miRNA-361-5p后，人肺癌A549細胞的集落形成數減少，細胞凋亡率和增殖抑制率升高，表明miRNA-361-5p過表達可抑制NSCLC細胞的增殖，并誘導其凋亡。本研究結果證實，circ_RNF111可靶向調控miRNA-361-5p的表達，NSCLC患者腫瘤組織中circ_RNF111與miRNA-361-5p的表達呈負相關，且抑制miRNA-361-5p的表達可逆轉干擾circ_RNF111對A549細胞凋亡和增殖的影響。表明circ_RNF111可能通過負調控miRNA-361-5p的表達來影響NSCLC的發生發展。

綜上所述，circ_RNF111可通過靶向負調控miRNA-361-5p的表達來抑制NSCLC細胞的增殖，并促進其凋亡。但本研究屬于前期實驗研究，尚需對其他腫瘤細胞進行實驗來驗證本研究結果。