高效重質石油降解菌群構建及降解性能評價

汪潤民，張曉東，徐成華，于丹丹，余冉

（1 東南大學能源與環境學院，江蘇 南京 211189；2 江蘇省地質礦產局第一地質大隊，江蘇 南京 210041）

隨著石化工業的發展，石油對水生和陸地環境的污染受到廣泛關注。疏水性的石油烴在水面形成油膜，阻斷大氣與溶解性氣體的交換，破壞水生生態系統。石油中的重質組分，如膠質、瀝青質等會破壞土壤結構，分散土粒，降低土壤的透水性，改變土壤水分運動狀況的同時，降低土壤有效磷、氮的含量。此外，環境中石油的積累會導致人體嚴重致癌、致畸和基因突變，并導致多種并發癥。故石油污染治理一直受到高度關注。

石油污染場地的修復方法主要分為物理法、化學法和生物法。物理法主要包括攔截、吸附和萃取等。物理法具有回收率高的優點，但其處理成本過高，對環境的破壞不容忽視。化學法通過添加消油劑、凝油劑、表面活性劑等實現石油的乳化分解并結合化學氧化等技術手段實現石油污染物的完全去除。然而處理過程中使用的化學藥劑會帶來二次污染，對原生環境造成較嚴重的破壞。生物法主要是通過向污染區域添加石油降解菌劑或生物刺激劑，結合對目標場地環境條件的調控，利用微生物的代謝活動實現石油污染物的降解。近年來，生物法以其環境友好、成本低、高效等特點受到廣泛關注。在國內，微生物修復技術在勝利油田、遼河油田和吉林油田污染場地進行的工程應用便累計處理超120kt 污染土壤，取得了巨大的經濟和生態效益，故石油污染場地的微生物修復技術具有良好的修復效果及應用前景。

石油由飽和烴、芳香烴、膠質、瀝青質四種組分構成。重質石油（以下簡稱重油）是相對密度大于0.9 的石油，其中的膠質和瀝青質含量較高，造成重油黏度大且降解困難。傳統石油污染場地修復相關研究中研發的生物菌劑一般為高效石油降解單菌，或是單菌復配的混合菌群；目標污染物大多為汽油、柴油或芳烴等分子量相對較小的污染物。Lucia 等在墨西哥灣的含油污泥中篩得菌株sp.對原油中的芳烴餾分具有明顯的降解作用。張小梅等從大慶油田的含油污泥中篩選出一株既分泌表面活性物質又能降解總石油烴的菌株，可降解油泥中約70%的總石油烴。然而，基于石油成分的復雜性，單一菌株對污染物質生物降解難易程度差別大、生物降解路徑很難明確，并可能產生具有環境毒性的中間產物；此外不同的細菌生長的最適溫度、pH、鹽度、對石油的各個組分的毒性耐受性等均存在一定差異。與單一細菌相比，混合菌群因為其催化酶的多樣性。可對難降解成分實現協同降解。此外，混合菌群還可以在不斷變化的環境中保持高效的生物降解能力。故獲得可廣譜降解所含石油組分及其降解中間產物的高效石油降解混合菌劑尤為重要。目前，已有研究者開展了關于未經純化的混合菌群的效果研究，如Duc 等通過將假單胞菌和葡萄球菌混合培養，實現對硫丹的厭氧降解，效率從20%提升到34%。Zhao等證實混合菌群中微生物的協同作用可以增強混合菌群的穩定性和耐受性，提升高pH 污泥脫硫性能。Li等研究發現，真菌和污染土壤中菌群的協同代謝可以明顯提高土壤中萘的降解效率。左麗敏等在江漢油田石油污染土壤中馴化出了以石油為唯一碳源的微生物混合菌群，并在35 天內降解了30%的石油。但有關混合菌劑對不同石油組分尤其是重油組分的降解潛力以及降解過程中混合菌劑的優勢功能菌組成變化規律的相關研究仍相對缺乏。本研究通過構建重油降解高效混菌，根據降解不同時段的菌群結構變化，從而確定降解過程不同階段的主要功能菌屬；同時通過降解前后石油組分內結構和官能團的變化，評價混合菌群的降解性能。

1 實驗試劑及方法

1.1 實驗樣品及培養基

降解實驗所用菌種來源于實驗室前期已馴化完成的石油降解混合菌群SD、GS、JS（實驗室前期從源于山東東營、江蘇徐州及甘肅重油污染土壤馴化而來的混合菌群）及本次從青島某油井污染土壤中馴化得到的混合菌群QD；實驗用石油來自江蘇某油田，膠質與瀝青質總質量分數約為30%，相對密度0.91，屬重油。

試驗用菌群富集培養基（MM1）：MgSO·7HO 0.5g/L、KHPO1.5g/L、KHPO2g/L、NHCl 1.2g/L，石油2%、pH 6.5～7、微量元素液1mL/L ；石油降解試驗培養基：MgSO·7HO 0.5g/L、KHPO1g/L、KHPO2g/L、NHCl 1.2g/L，石油0.5%、pH 7～7.5、微量元素液（組成為CaCl2g/L、FeSO1g/L、CuSO1g/L、 ZnSO0.05g/L、 MnSO0.05g/L）1mL/L。

1.2 實驗方法

1.2.1 QD/QM高效重油降解混菌的馴化培養

稱取20g 污染土壤于30mL 富集培養基，于30℃、150r/min 下混合培養50 天，每隔7～10 天補充20mL 富集培養基。靜置取50mL 上層菌液，在8000r/min 下離心5min，去除上清液，用相同體積的無菌PBS重懸后4℃保存。QM混合菌群由四種混菌菌液（OD=0.6）以體積比為1∶1∶1∶1 混合后，量取5mL 加入100mL 滅菌MM1 培養基中，在30℃、150r/min 條件下進行2～3 個周期，每個周期50～60天的恒溫馴化培養。

1.2.2 重油降解試驗搭建

分別向2 組100mL 的滅菌MM1 培養基中加入5%OD=0.6的QD混菌或QM混菌菌液，以無菌培養液為空白組，30℃、150r/min恒溫培養，每隔5～8 天平行取3 個樣品檢測石油降解率。石油降解率測定方法采用GB/T 5750.7—2006《水中石油類物質檢測方法——重量法》進行檢測。

1.2.3 石油族組分層析分析

石油中包含四類組分：飽和烴（飽和分）、芳香烴（芳香分）、膠質和瀝青質。將重量法測定后的石油樣品用于族組分層析實驗，層析實驗方法參照SY/T 5119—2016《巖石中可溶有機物及原油族組分分析》。試樣中各族組分質量分數按照式(1)計算。

式中，為稱量瓶+族組分+空白值的質量，g；為稱量瓶質量，g；為空白值，g；為試樣質量，g；X分別表示飽和烴、芳烴、膠質和瀝青質的質量分數。

1.3 紅外光譜分析

使用Nicolet iS10 傅里葉變換紅外光譜儀（美國Thermo fisher）進行石油組分紅外光譜分析。通過壓片法制備直徑為13mm、厚度為1mm的固體試樣透明薄片，置于夾持器中；將夾持器放入儀器的試樣吸收池位置，起始透光率＞20%時，即可進行測量；通過譜圖中的特征峰及振動變化確定石油中的特征組分及結構的變化。

1.4 菌群分析鑒定

使用E.Z.N.A.soil DNA kit （Omega Bio-tek,Norcross, GA, U.S.） 進行樣品總DNA 抽提，使用1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的提取質量，使用NanoDrop2000 測定DNA 濃度和純度；使 用 338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和 806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) 對16S rRNA 基因V3-V4 可變區進行PCR 擴增，每個樣本3 個重復；利用Illumina 公司的NovaSeq PE250平臺進行測序。

使用fastp（version 0.20.0）軟件對原始測序序列進行質控，使用FLASH（version 1.2.7）軟件進行拼接：使用UPARSE軟件（version 7.1），根據97%的相似度對序列進行OTU聚類并剔除嵌合體。利用RDP classifier（version 2.2）對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva 16S rRNA 數據庫（version 138），設置比對閾值為70%。

2 結果與討論

2.1 混合菌群的篩選及鑒定

從青島某油井污染土壤中富集獲得菌群QD 并進行了長達半年的以重油為唯一碳源的連續強化馴化，并將強化后的QD菌群與前期所獲JS、SD、GS標準富集菌液（OD=0.6）以體積比1∶1∶1∶1的比例混合（本文只研究等比例復配條件下的重油降解，有關混合比例對重油降解的影響有待后續研究），得到混合菌群QM。QM混合菌群生長周期約為14 天，培養12～14 天時生物量可達到最大值，約為4×10CFU/mL，如圖1所示。

圖1 QM菌密度與OD600值線性關系標準曲線與其生長曲線

在重油降解過程中，分別在不同階段對QM混合菌群進行采樣分析，降解實驗前期（10天）、中期（30天）及后期（50天）。混合菌群的多樣性指數如表1所示。在重油降解實驗的整個過程中，混合菌群的多樣性及均一性水平總體穩定。隨著降解時間的延長，菌群ace 指數與chao 指數逐漸增大，表明隨著降解實驗的進行，混合菌群豐度不斷增大。生物降解各階段優勢菌屬如表2所示，優勢菌屬相對及絕對豐度差異如圖2(a)、(b)所示。在重油生物降解前期，占主導地位的菌屬為、、等；而隨著反應時間的延長，及屬細菌的豐度逐漸升高。在石油降解及石油污染土壤生物修復的過程中均被證實可起到重要作用，尤其在汽柴油污染土壤中其豐度優勢明顯；對石油中的重質或難降解組分具有長期緩慢的降解效用；具有較強的耐受石油污染的能力，而可產生表面活性劑，有助于石油，尤其是多環芳烴菲的降解。 綜 合 推 測 ，及屬的細菌在石油重質組分及難降解組分的降解中或起主要作用。

圖2 重油生物降解不同階段QM降解菌群優勢菌屬豐度差異（前15種）

表1 QM混合菌群多樣性指數

表2 重油生物降解各階段優勢菌屬（＞5%）

2.2 混合菌群重油降解分析

分別使用連續強化馴化前后的QD 菌群及QM菌群開展重油降解研究。重油在降解過程初期附著于瓶底；隨著時間的推移，部分石油以油滴的形式分散到菌液中，到40～50天后，菌液逐漸變成淡黃色，菌液中的油滴量明顯逐漸變小。

強化馴化前后的QD 菌群及QM 菌群對重油石油50天的降解效率如圖3所示。三種混菌均對試驗用重油具有降解效果，重油降解率總體隨反應時間延長而增加。在50天內，強化培養前的QD混合菌群僅能去除25.42%±2.12%的重油，強化后的QD混合菌群則可去除41.57%±1.08%的重油，而QM混合菌群在20 天內即可去除42.31%±3.51%的重油，50 天時可去除53.48%±2.89%的重油。表明強化連續馴化培養可以有效的提升混合菌群的重油降解效果，而進行菌群復配后的混合菌群在進一步提升重油降解效果的基礎上，還可以實現更加高效的重油降解。故推測連續培養過程同時也是混合菌群的定向馴化過程，促使菌群結構向有利于重油降解的方向進化。

圖3 連續培養前后的QD混菌及四合一混合菌群（QM）的重油降解率

為了研究菌群對石油各族組分的降解，對強化后的QD 菌群及QM 混合菌群降解的石油樣品進行族組分分析（圖4）。結果顯示，就輕質組分來說，50天時，強化QD菌群及QM菌群分別可實現46.93%、73.71%的飽和烴組分降解以及40.83%、53.17%的芳香烴組分降解。同時，對兩種混合菌群的石油族不同組分的降解效率進行相關性分析（表3）發現，樣品中飽和烴及芳香烴含量與時間均成顯著負相關。QM 菌群及強化QD 菌群均能實現對輕質組分的有效降解，且QM菌群的降解效率及降解效果均明顯優于強化QD菌群。

表3 降油菌群作用下各組分質量與時間的相關系數及50d降解率

圖4 混合菌群對石油族不同組分隨時間的降解情況

就難降解的重質組分來說，強化QD 混合菌群降解樣品中膠質含量與時間成顯著負相關，瀝青質含量與時間無明顯相關關系，而QM混合菌群降解樣品中的結果恰恰相反。強化QD混合菌群可以實現對36.15%膠質的有效降解而不能實現對瀝青質的有效降解，而QM 混合菌群可以實現對25.56%±5.40%的瀝青質的有效降解而不能實現對膠質的有效降解。這可能是因為QM混合菌群在有限時間內僅將重質組分降解為結構更為簡單的短鏈烴，對膠質、飽和烴和芳香烴組分進行了“補充”。

2.3 混合菌群重油降解性能評價

選取QM 混合菌群降解石油過程中0、30 天、50 天的樣品進行層析和傅里葉紅外光譜分析（圖5）。結果顯示，混合菌群在實現簡單結構的降解之外，在難降解有機物的活化及輕量化過程中存在明顯的積極作用。2930cm、2850cm為—CH—的伸縮振動吸收峰，460cm、1380cm為—CH—的面內彎曲振動吸收峰。在飽和烴降解過程中烷基吸收峰的高度降低，表明脂肪烴甲基、亞甲基的降解是重油降解的一種重要途徑；在芳香烴、膠質和瀝青質中烷基吸收峰的高度逐漸升高，且在降解中后期尤為明顯，表明重油降解過程會導致芳香烴、膠質、瀝青質的飽和度增大，直接表現為苯環的開環。1000～650cm的區域為C—H 面外彎曲振動區，為苯環取代基特征振動吸收峰。如圖5(b)～(d)所示，芳香烴及膠質組分在重油降解過程中后期出現了明顯的吸收峰，表明苯環上取代基增多，混合菌群對苯環大Π 鍵有活化作用。1260cm、1120cm及1080cm為酯基和醚基特征吸收峰。降解實驗中后期芳香烴和膠質中出現了降解前僅存在于瀝青質中的酯基和醚基的特征吸收峰，表明混合菌群可實現含酯基及醚基的多環縮合環化合物的部分降解。綜上所述，除實現甲基、亞甲基等輕質基團的降解外，混合菌群還可能通過多環結構的開環、活化及酯基醚基等特征基團的輕量化等方式，提高難降解有機物的可降解性。

圖5 重油樣品紅外譜圖

3 結論

混合菌群的連續強化培養及混合菌群間的復配可顯著提高其重油降解能力。混合菌群QM50天內重油降解率可達53.48%±2.89%，瀝青質降解率可達25.56%±5.40%，成功實現單菌難以達到、高效且穩定的重油及重質組分的降解。混合菌群中起主要降油作用的優勢菌屬為、、、等且在降解過程不同階段中存在明顯差異， 其中、等菌屬的細菌或對重質及難降解組分有著優良的降解性能。QM混合菌群降油過程中改變了重油，尤其是重油重質組分結構，使重質組分飽和度增大、多環結構活化，顯著提升了重油的生物可降解性。