硫酸鹽還原菌法固定酸性礦山廢水中重金屬的研究進展

聞倩敏，秦永麗，鄭君健，韋巧艷，張媛媛，蔣永榮

（桂林電子科技大學生命與環(huán)境科學學院，廣西 桂林 541004）

酸性礦山廢水（acid mine drainage，AMD）是采礦業(yè)所面臨的最嚴重的環(huán)境問題之一，其主要來源于采礦過程中礦井內(nèi)的天然溶濾水、選礦廢水、選礦廢渣堤堰的溢流水以及礦渣堆積場的浸出水等，此類廢水的pH通常低至3.0以下，富含硫酸根離子（SO）、鐵離子（Fe、Fe）及一定濃度有毒金屬離子（如Pb、Cu、Zn、Cd等）。在我國，AMD 年排出量占全國工業(yè)廢水總排放量的10%，但僅有不到5%的處理率。未經(jīng)處理的AMD 往往對周圍水域、土壤和生物多樣性造成嚴重污染和破壞，并且重金屬離子通過食物鏈進入人體會對健康產(chǎn)生巨大危害。因此，探索和尋求行之有效的AMD 治理方法與技術(shù)顯得尤為必要和緊迫。這對礦區(qū)農(nóng)業(yè)和經(jīng)濟的持續(xù)發(fā)展、保障當?shù)鼐用竦纳硇慕】稻哂兄匾饬x。

傳統(tǒng)的AMD 治理方法如化學法、物理法和物理化學法等，大多具有成本高、易產(chǎn)生二次污染等缺點；而微生物法由于具有高效性、低能耗和環(huán)境友好等優(yōu)勢，受到了研究人員的關(guān)注，其中的硫酸鹽還原菌（sulfate-reducing bacteria，SRB）法更是吸引了廣大研究者的目光，成為目前研究的熱點。利用SRB產(chǎn)生的硫化物沉淀廢水中的重金屬不僅成本低、無二次污染，還能回收有用金屬，實現(xiàn)資源再利用，是一種極具潛力的生物處理AMD 技術(shù)。大量文獻也表明SRB 處理AMD 效果顯著，但是存在兩方面原因制約了SRB 法在AMD 治理中的工程化應用。一方面是pH 對各類金屬離子去除效果的影響非常大，另一方面厭氧過程中金屬沉淀夾帶污泥不易分離，最后由于金屬沉淀物大量積累導致厭氧反應器運行失敗。

事實上，如何將多種重金屬分級沉淀并且分相分離出來，是SRB 工藝能夠穩(wěn)定運行的關(guān)鍵，也是采用SRB法處理AMD的環(huán)保工作者面臨的難題。目前，關(guān)于SRB 法處理AMD 的研究主要集中在不同重金屬的處理效果、去除機理、影響因素和工藝技術(shù)等，對于多種重金屬的分級沉淀與持久性礦化固定缺乏系統(tǒng)分析。因此，本文對該領(lǐng)域的研究進行綜述，分析其存在的問題，并對今后的研究發(fā)現(xiàn)提出建議。

1 SRB法去除酸性礦山廢水中重金屬的原理

2 SRB法分級沉淀酸性礦山廢水中多種重金屬的工藝

pH 對各類金屬離子去除效果的影響非常大，這是因為各種金屬硫化物的和起始沉淀pH不同（見表1）。為解決這一問題，研究者不斷改進工藝和開發(fā)新型反應器，發(fā)現(xiàn)通過分級pH 控制，可以在SRB 處理AMD 的過程中實現(xiàn)對各種重金屬的分級沉淀和選擇性回收。其中生物反應與化學沉淀分離式多級pH 控制工藝和多隔室厭氧折流板反應器（anaerobic baffled reactor，ABR）工藝備受關(guān)注。

表1 酸性礦山廢水中主要重金屬硫化物的Ksp和沉淀起始的pH條件

2.1 分離式多級pH控制工藝

生物反應與化學沉淀分離式多級pH 控制工藝可將硫酸鹽還原厭氧反應器和金屬硫化物沉淀池分置，AMD 不直接與SRB 接觸。這種工藝首先在硫酸鹽還原厭氧反應器中將SO還原為HS，然后利用載氣（如N）吹脫反應器中的HS 到AMD 沉淀池，同時在AMD 沉淀池逐級加堿從而控制多級pH，由此實現(xiàn)對各種重金屬的分級沉淀和選擇性回收。為了獲得更佳的沉淀效果，提高各種重金屬的處理效率，國內(nèi)外研究者利用了不同類型的分離式工藝裝置開展試驗（詳見表2），從而獲得較優(yōu)的處理參數(shù)，對金屬離子的沉淀率高達90%以上。

表2 分離式多級pH控制的工藝應用

分離式多級pH 控制工藝的獨特之處在于，它允許生物產(chǎn)硫化物系統(tǒng)和金屬沉淀系統(tǒng)作為兩個獨立的單元并行運行，并通過逐級加堿等方式分類回收AMD 中的重金屬離子。但是該工藝載氣再循環(huán)需要高能量輸入、多段式工藝復雜以及逐級加堿等增加成本。

2.2 厭氧折流板反應器工藝

ABR 集上升流厭氧污泥床（UASB）和分階段多相厭氧反應技術(shù)（SMPA）于一體，是一種理想的多段分相、混合流態(tài)處理工藝，運行中的ABR 是一個整體為推流、各隔室為完全混合的反應器，從而使具有不同營養(yǎng)生態(tài)位的功能菌群依次分布在反應器各隔室中，形成良好的功能分區(qū)，即微生物相分離特性。本文作者課題組采用五隔室ABR 處理硫酸鹽有機廢水，沿程形成明顯的多生物相分離，反應器前、中、后端的pH 分別為4.0～4.5、5.5～6.0 和7.0 左右，在不加堿或少量加堿條件下，可為AMD 中不同重金屬沉淀提供良好的pH 梯度。Sahinkaya 課題組利用四隔室ABR 針對AMD 中重金屬去除進行了研究，通過調(diào)控各項參數(shù)優(yōu)化反應器運行性能，能夠同時去除COD、SO和多種重金屬（Co，Cu，F(xiàn)e，Ni 和Zn），X 射線熒光光譜（XRF）分析結(jié)果表明，污泥中存在一定量的金屬硫化物。這為利用ABR 硫酸鹽還原體系處理AMD 并分級沉淀各種重金屬提供了可能。

近年來，利用ABR 硫酸鹽還原體系處理AMD并分級沉淀各種重金屬的研究見表3。與分離式多級pH控制工藝相比，ABR 工藝設(shè)計簡單，成本較低，能有效截留生物體，集生物產(chǎn)硫系統(tǒng)和金屬沉淀系統(tǒng)于一體，處理AMD 時可以在一個反應器內(nèi)實現(xiàn)硫酸鹽還原、金屬去除、堿度生成和過量硫化物氧化，是一種高效的厭氧反應器。其中大部分金屬在前面隔室便可形成沉淀除去，而不會對反應器的運行造成嚴重的損害，通過這種方式，有價值的金屬能在不中斷反應器運行的情況下回收利用。此外，ABR 生產(chǎn)的硫化物可以部分氧化為單質(zhì)硫，實現(xiàn)硫回收，避免有害硫化物排放。

表3 多隔室厭氧折流板反應器在重金屬廢水中的工藝應用

值得注意的是，上述研究大多偏重于調(diào)控反應器運行參數(shù)去除重金屬，并未對污泥中金屬硫化物沉淀的持久性礦化固定進行系統(tǒng)分析。

3 SRB法厭氧污泥中金屬硫化物的生物礦化

事實上，如何將污泥中夾帶的金屬硫化物沉淀分離出來，是厭氧SRB 工藝能夠穩(wěn)定運行的關(guān)鍵，是采用生物法處理各類含硫酸鹽重金屬廢水的環(huán)保工作者都會面臨的難題。值得關(guān)注的是，自然界中SRB誘導的生物礦化現(xiàn)象給了人們重要啟示。

3.1 SRB介導的生物礦化成礦

生物礦化是指生物介入的無機礦物形成過程，其實質(zhì)是生物影響下進行的晶體生長過程。美國科學家Banfield課題組首次在礦坑內(nèi)的生物膜中發(fā)現(xiàn)了SRB生物礦化形成的閃鋅礦礦物聚集體（見圖1），掃描電子顯微鏡和能量色散X 射線分析表明，該聚集體由直徑為2～5nm 的閃鋅礦晶體組成，揭示在高濃度重金屬離子的礦山環(huán)境中，在局部缺氧條件下SRB可以通過生物的誘導礦化作用固定礦化重金屬。在此基礎(chǔ)上，García 等利用從某黃鐵礦帶尾礦池底部采集的SRB混合種群，對該尾礦堆置場排放的污染液進行處理，結(jié)果表明在pH＞4.0時，SRB 在含有9000mg/L SO、30mg/L Fe(Ⅱ)和100mg/L Cu(Ⅱ)的環(huán)境中生長9 天后，SO去除率達85%，F(xiàn)e和Cu去除率幾乎達到100%，并發(fā)現(xiàn)納米級FeS和CuS形式礦物。這些研究表明，SRB生物成因的金屬硫化物礦物具有一定的形貌和結(jié)構(gòu)，但顆粒粒徑一般很小，為納米級。顯然，這種納米級金屬硫化物礦物顆粒還難以與污泥分離。劉牡丹等研究表明，當污泥中硫化礦的顆粒達到微米級可采用物理方法進行分選回收。而微米級礦物需由大量隨機取向的、納米直徑的礦物聚集而成，因此如何促使金屬硫化物沉淀聚集生長形成微米級礦物是目前研究者需要解決的關(guān)鍵問題。

圖1 SRB細胞壁上納米礦物團聚體[44]

還有研究表明，生物礦化過程實質(zhì)是在生物的特定部位，在一定的環(huán)境條件下，在生物產(chǎn)生的有機物質(zhì)的控制和影響下，將溶液中的離子核化、沉淀和相變?yōu)楣滔嗟V物的過程。大量生物地質(zhì)學和礦物學方面的研究表明，SRB在各種形式礦床中參與了成礦過程，SRB在草莓狀黃鐵礦形成過程中不僅是黃鐵礦前體硫鐵礦的硫源，而且影響整個形成過程中黃鐵礦的成核速度。Lin等對南海北部天然氣水合物賦存區(qū)沉積物中自生礦物特征的研究，發(fā)現(xiàn)在SRB 及其共存微生物的活動下，可產(chǎn)生大量的黃鐵礦莓球（平均粒徑＞20μm，標準偏差＞3.0μm）和單質(zhì)硫顆粒（粒徑10～20μm），且黃鐵礦與單質(zhì)硫顆粒共存呈“離群”的粒徑特征，見圖2。最近還有文獻表明，將鉆孔鹽沼地下幾米深處獲得的磷石膏接種至富含重金屬（Fe，Zn，Cu，Cd）的培養(yǎng)基中，分別以馬糞、豆類植物堆肥發(fā)酵等有機酸組分作為碳源，也礦化形成了草莓狀黃鐵礦、多面體黃鐵礦、草莓狀黃銅礦和方鉛礦，其莓球及多面體的粒徑在10～20μm范圍，見圖3。

圖2 天然氣水合物賦存區(qū)沉積物中自生礦物的SEM圖

圖3 實驗培養(yǎng)基中反應產(chǎn)物的SEM圖[55]

3.2 SRB生物礦化成礦影響因素

對于處理AMD 的硫酸鹽還原厭氧體系，SRB分泌的EPS、體系中的離子強度及pH 是誘導金屬硫化物礦化成礦的重要因素，并影響礦化產(chǎn)物物相、形貌、結(jié)構(gòu)及其元素組成。

3.2.1 胞外聚合物

在AMD 處理的硫酸鹽還原體系中，污泥是核心，是SRB 及其他共存微生物的載體，也是微生物礦化重金屬形成礦物的載體。污泥被微生物分泌的EPS包裹，其通常含有多糖、蛋白質(zhì)、核酸、腐殖酸和脂類等聚合物分子。研究表明，EPS易于形成膠體網(wǎng)絡(luò)從而能夠?qū)⑽⑸锉Ａ粼谖勰嘀校彌_生態(tài)環(huán)境對微生物的沖擊和毒性（如pH、鹽度、重金屬離子）。另有文獻指出，載有微生物的污泥分泌的EPS比純培養(yǎng)的細菌分泌的EPS量更多且能更好地絡(luò)合重金屬。

Banfield等發(fā)現(xiàn)微生物代謝產(chǎn)生的EPS可以在很大程度上影響金屬硫化物的尺寸、形貌和結(jié)構(gòu)。Gadd的研究結(jié)果表明微生物分泌的EPS與其介導的礦物形成有關(guān)。最近，Do等從.LRP3中提取EPS，通過生物礦化誘導形成Cu(PO)(OH)晶體；Xing 等利用腐殖酸使菱鐵礦轉(zhuǎn)變?yōu)獒樿F礦，礦物粒徑為5～20μm。本文作者課題組利用ABR 處理硫酸鹽有機廢水長期運行，顆粒污泥中優(yōu)勢SRB 為屬，顆粒污泥表面有草莓狀黃鐵礦形成，黃鐵礦莓球呈現(xiàn)“離群”的粒徑特征，莓球粒徑約20μm，組成莓球粒的多面體微晶粒徑約2.0μm。此外，顆粒污泥表面的單質(zhì)硫（S）顆粒被大量EPS 包覆，并且形成礦物和單質(zhì)硫顆粒的顆粒污泥中的EPS組分和官能團與未形成礦物的明顯不同。

由此推測，微生物分泌的EPS在微生物礦化成礦過程中起決定性的作用，與礦物形成過程的結(jié)晶、相變和尺寸大小相關(guān)；同樣地，SRB 分泌的EPS 是聯(lián)系SRB 與金屬硫化物的紐帶，SRB-EPS-金屬硫化物三者相互作用誘導形成了硫化礦，同時這三者間相互作用的關(guān)鍵影響因子是環(huán)境液相介質(zhì)組分和環(huán)境條件。

3.2.2 離子強度

環(huán)境中離子強度會影響金屬硫化物的成核率，進而影響金屬硫化物的團聚與最終形態(tài)。離子強度的不同會導致SRB 代謝作用下缺氧終產(chǎn)物的不同，從而影響礦化產(chǎn)物的物相。張鑫通過模擬膏鹽層不同離子強度，研究SRB 在不同離子強度下的代謝情況及其對晶體產(chǎn)物的影響，發(fā)現(xiàn)高離子強度會對SRB 的生長代謝活性產(chǎn)生抑制作用，進而對晶體沉淀產(chǎn)生抑制作用。田琳奇研究發(fā)現(xiàn)高離子強度促進了CdS的形成，使CdS成核率增加，形成了更多的CdS晶體，且高離子強度能夠增大其晶體高度。Mullaugh 等通過實驗探究不同離子強度下CdS的團聚時發(fā)現(xiàn)，高離子強度能夠成倍地增加CdS粒子的粒徑及促進CdS的團聚。

3.2.3 pH

在SRB法處理AMD過程中，pH會影響其中的金屬離子強度，從而導致SRB 硫酸鹽還原體系中金屬硫化物的礦化速率不一樣。Liu 等研究發(fā)現(xiàn)不同初始pH 條件下硫化物的晶體生長方式無明顯差異，都有從無定形態(tài)向晶態(tài)轉(zhuǎn)化的過程，但是會影響晶體數(shù)量和高度；在低pH 條件下，SRB 生長遲滯進而硫酸鹽還原速率降低，從而導致較低的金屬硫化物晶體數(shù)量與高度。董凈等研究SRB法處理重金屬廢水并分析礦化產(chǎn)物特性時發(fā)現(xiàn)，在SRB 鈍化金屬離子的過程中液相pH 不斷升高，有利于誘導合成金屬硫化物晶體。Warthmann 等發(fā)現(xiàn)在SRB 誘導礦化的實驗體系中，溶液pH 的改變能影響硫酸鹽礦物生成速率，并最終影響礦物種類和形貌特征。

3.3 SRB參與的生物礦化過程微觀機理

微生物通常以生物誘導礦化（biologically induced mineralization，BIM） 和 生 物 控 制 礦 化（biologically controlled mineralization，BCM） 兩種方式參與礦物的形成過程，應用于重金屬污染治理的礦化技術(shù)以BIM 為主。BIM 是被動礦化的過程，微生物的代謝產(chǎn)物影響胞外微環(huán)境的理化性質(zhì)，并在局部環(huán)境中形成過飽和狀態(tài)，促進重金屬離子形成沉淀，進而影響生物誘導礦化過程。

根據(jù)文獻資料，SRB 具有聚積溶液中低濃度SO的能力，SO首先在細胞外積累，然后通過SRB細胞膜進入細胞內(nèi)。在SRB細胞內(nèi)，還原硫酸鹽包括分解、電子傳遞和氧化三個階段：首先在分解階段，有機物在厭氧條件下被分解為乙酸、CO等，并產(chǎn)生少量的ATP；電子傳遞階段是分解階段產(chǎn)生的高能電子通過SRB 特有的電子傳遞鏈（如黃素蛋白、細胞色素C等）逐級傳遞，同時產(chǎn)生大量的ATP；在氧化階段，電子被傳遞給SO，并將其還原為S，同時消耗大量的ATP，此階段還包括SO激活、腺苷酰硫酸（APS）還原、SO還原等中間過程。在SRB 細胞內(nèi)還原SO產(chǎn)生的S和其他代謝產(chǎn)物通過細胞膜被排出體外，進入周圍環(huán)境。對于SRB 細胞內(nèi)還原SO生成S的機理已經(jīng)有相當深入的研究，但是，在體外S與重金屬生成的硫化物沉淀是如何誘導礦化形成礦物的呢？該過程的微觀機理尚未見詳細報道。

曾有文獻報道，SRB通過提供生物膜來促進生物礦化過程的發(fā)生，能夠在其細胞表面發(fā)生成核作用，從而促進自然環(huán)境中金屬硫化物晶體的形成。最近，Duverger 等通過透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在SRB細胞外的EPS中可聚集直徑達幾百納米的黃鐵礦球粒。Berg等在SRB生物礦化實驗中，觀察到草莓狀黃鐵礦與細胞外的腐殖質(zhì)、DNA等有機物結(jié)合在一起，推測這些有機物可能為黃鐵礦的沉淀提供了吸附成核位點。Bontognali 等和Kenward 等進一步研究SRB 細胞表面及EPS 的官能團對生物礦化成礦的影響，發(fā)現(xiàn)帶有諸多呈電負性的官能團（如羧基、磷酰基、羥基等）能夠吸附金屬陽離子，同時為礦物的形成提供成核位點和早期生長模板。黃亞蓉的實驗結(jié)果也表明，SRB裸細胞和EPS上高濃度高密度的羧基和磷酰基基團可促進無序礦物礦化。

此外，Aloisi 等和Bontognali 等在硫酸鹽還原菌和進行礦化實驗中發(fā)現(xiàn)，礦物沉淀主要是在菌體附近的胞外聚合物球粒上進行的，而非直接發(fā)生在細胞壁上，避免細胞表面的礦物沉淀。由此提出，微生物在調(diào)控礦物生成的過程具有一種自我保護機制，以避免在細胞表面出現(xiàn)不可控的礦物沉淀所引起的包埋，同時通過調(diào)控礦物的形成降低細胞周圍溶液中的金屬離子濃度，減少這些金屬離子對細胞的毒害作用，為微生物提供更為有利的生存環(huán)境。

綜上所述，本文作者推測SRB 參與的生物礦化過程如下：①SRB表面及EPS帶有諸多呈電負性的官能團，吸附并聚集周圍溶液中重金屬離子（Me）于細胞表面或部分進入細胞體內(nèi)；②SRB通過細胞膜聚集廢水中SO并進入體內(nèi)，在細胞內(nèi)還原SO生成S，少部分S在體內(nèi)與進入細胞內(nèi)的Me結(jié)合生成MeS沉淀后排除體外，大部分S排出體外與細胞表面的Me 結(jié)合生成MeS 沉淀；③MeS沉淀在EPS及細胞表面官能團的作用下，通過結(jié)晶、成核形成微小的納米礦化產(chǎn)物，進而聚合在一起形成大顆粒的礦物，見圖4。

圖4 SRB誘導金屬硫化物礦物形成過程示意圖

然而，由于缺乏SRB 誘導沉淀顆粒物礦化成礦的直接觀察證據(jù)，無法深入了解SRB 在礦化過程所發(fā)揮的具體調(diào)控機制，該方向仍需進一步研究。

4 結(jié)語與展望

在目前SRB 法處理AMD 過程中，一方面由于各種金屬硫化物和起始沉淀pH不同造成各類金屬離子沉淀不穩(wěn)定，另一方面厭氧過程中金屬沉淀夾帶污泥不易分離，往往導致厭氧反應器運行失敗，從而制約了SRB 法在AMD 治理中的工程化應用。雖然國內(nèi)外實驗研究中取得了一些進展，然而，在硫酸鹽還原體系中，如何調(diào)控金屬硫化物沉淀形成可與污泥分離的礦物需要進一步探索，其中的生物礦化成礦機理更需要深入研究。因此，今后需要重點關(guān)注的研究內(nèi)容有：①研發(fā)多相分離硫酸鹽還原體系處理AMD 廢水，通過調(diào)控體系運行參數(shù)和內(nèi)部環(huán)境，實現(xiàn)最大程度地將AMD 中多種重金屬轉(zhuǎn)變?yōu)榱蚧锏V物，獲得硫酸鹽還原體系成礦的技術(shù)參數(shù)；②利用同位素、K邊X射線吸收近邊結(jié)構(gòu)（K 邊-XANES）、原子力顯微鏡（AFM）、透射電子顯微鏡-電子選區(qū)衍射（TEM-SAED）和高分辨率透射電子顯微鏡（HRTEM）等先進技術(shù)，深入研究硫酸鹽還原體系污泥中金屬硫化物結(jié)晶、成礦的物相演變過程；③利用現(xiàn)代分子生物學手段，深入分析硫酸鹽還原體系污泥中金屬硫化物結(jié)晶、成礦的微生物群落演替及功能菌群交互作用規(guī)律；④綜合利用環(huán)境科學、生物地質(zhì)學和地質(zhì)礦物學的研究思路和研究方法，以硫酸鹽還原厭氧污泥為研究核心，探究SRB、EPS、金屬硫化物、液相介質(zhì)之間的交互作用關(guān)系，從深層次挖掘重金屬微生物固定與礦化的微觀過程及其調(diào)控因素，揭示硫酸鹽還原體系礦化固定AMD中重金屬成礦的機制。