一株產低溫脂肪酶酵母菌的鑒定及酶學性質

史程風，賈冉冉，閻振麗，惠豐立

（1 南陽師范學院生命科學與農業工程學院，河南 南陽 473061；2 河南天冠企業集團有限公司車用生物燃料技術國家重點實驗室，河南 南陽 473000）

脂肪酶（EC3.1.1.3）又稱為三酰基甘油水解酶，不僅可催化甘油三酯水解為游離脂肪酸和甘油，還能催化酯化、酯交換、酸解、醇解和氨解等反應。作為水解酶，脂肪酶參與的反應過程中不需要輔因子，表現出良好的化學、區域以及對映選擇性，因而成為最通用的生物催化劑。

目前工業上應用廣泛的脂肪酶是中高溫脂肪酶。中高溫脂肪酶在30～50℃之間表現出較高酶活性，在0℃時幾乎為零，而低溫脂肪酶在0～20℃范圍內就可以表現出較高的酶活性，在30℃左右酶活性達到最高。低溫脂肪酶為適應寒冷環境進化出了一系列的結構特征，表現為高靈活性、高彈性，具有高催化活性、低活化能、高底物親和力、熱不穩定性等特點，在低溫環境中具有廣泛的應用前景。

在生物質能源領域，低溫脂肪酶催化酯化反應生產生物柴油可代替目前以酸或堿為催化劑的化學法，可解決工藝復雜、能耗高、污染大等制約其發展的瓶頸，且使生物柴油具有良好的發動機低溫啟動性能。在養殖業，低溫脂肪酶水解油脂產生的短鏈脂肪酸可作為生理功能添加劑替代傳統抗生素，用于維護腸道健康，解決仔豬斷奶應激問題。低溫脂肪酶還可解決溫度處理帶來的諸多難題，如在油脂、啤酒及奶制品等加工過程中可避免長時間高溫滅活酶而影響其質量和風味。在皮制品工業，低溫脂肪酶可以實現對皮革低溫脫脂，省卻加熱和冷卻步驟，在不損壞皮革質量的基礎上省時省耗。工業廢水為自然溫度，甚至10℃以下，利用低溫脂肪酶可實現冷水除污，有利于節省能源，保護環境。

現有報道的低溫脂肪酶最適反應溫度一般為24～37℃，主要來源于海洋深處、極地和高山地區等極端環境中的低溫微生物，主要包括耶式酵母屬（）、紅酵母屬（）、假單胞菌屬（）、耶爾森氏菌（）、芽孢桿菌屬（）、曲霉屬（）、沙雷氏菌屬（）、 伯克霍爾德氏菌屬（）等。為了尋找工業上有應用價值的低溫脂肪酶，國內對其產生菌已進行了較為深入的研究，但主要是細菌。謝玉婷等對伯克霍爾德氏菌sp.JXJ-16低溫脂肪酶的酶學性質進行了研究，該酶在35℃、pH 8.5～9 有最大水解活性，對硝基苯酚辛酸酯為最適底物。王春雨等研究了蘇云金芽胞桿菌sp.CZW001 低溫脂肪酶的性質，該低溫脂肪酶最適反應溫度為25℃，最適反應pH為8，對Ca有較大依賴性。國外學者Park 等篩選出一株嗜溫畢赤酵母NRRL Y-7723，但僅對該菌產低溫脂肪酶條件進行了優化。Maharana等從南極東部湖泊沉積物樣品中分離得到一株耐冷紅酵母sp. Y-23，該菌所產的低溫脂肪酶最適反應pH 為8，最適反應溫度為35℃，且在pH為5、溫度20℃時更具穩定性。

本文作者課題組從實驗室所保藏的55 株產低溫脂肪酶菌株中篩選出一株高產酵母菌株NYNU 19160，對該菌株進行鑒定，并對該菌株所產脂肪酶進行初步純化，研究其酶學性質，為工業低溫脂肪酶資源的開發及應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

55 株產低溫脂肪酶酵母菌株是從我國東北及西北地區采集的土壤樣品中分離獲得，保藏于本實驗室。

1.1.2 試劑與儀器

試劑：棕櫚酸對硝基苯酯（PNPP），上海麥克林生化有限公司；無水乙醇，天津市風船化學試劑科技有限公司；阿拉伯膠，美國生命科學與高科技集團公司；TritonX-100，北京索萊寶科技有限公司；Ezup 柱式酵母基因組DNA 抽提試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒，北京索萊寶科技有限公司。

主要儀器：YQT-33QCE 全自動生化培養箱，上海申安醫療器械設備有限公司；STIK 高壓蒸汽滅菌器，施都凱儀器設備上海有限公司；ZWYRD2403恒溫培養振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；磁力攪拌器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；多功能酶標儀，珀金埃爾默股份有限公司。

1.1.3 培養基

YM 液體培養基（g/L）：無水葡萄糖10，麥芽粉3，酵母粉3，蛋白胨5，pH自然。

YM 固體培養基：YM 液體培養基基礎上添加瓊脂20g/L。

羅丹明B 篩選培養基（g/L）：無水葡萄糖10，麥芽粉3，酵母粉3，蛋白胨5，瓊脂20，羅丹明B 0.01，三丁酸甘油酯乳化液1%（體積分數），pH自然。三丁酸甘油酯乳化液參照文獻[23]制備。

發酵培養基（g/L）：無水葡萄糖10，玉米漿40，三水磷酸氫二鉀6.6，硝酸鈉5，三丁酸甘油酯2.5，吐溫80 1，pH 7.0。

YCBS 固體培養基（g/L）：酵母碳源基礎17.9，硫酸銨0.1，瓊脂20。

5%麥芽粉固體培養基（g/L）：麥芽粉50，瓊脂20。

1%玉米瓊脂培養基（g/L）：玉米粉50，瓊脂10（需將玉米粉70℃水浴至水發白，用紗布過濾后添加瓊脂配制）。

2%玉米瓊脂培養基（g/L）：玉米粉50，瓊脂20（需將玉米粉70℃水浴至水發白，用紗布過濾后添加瓊脂配制）。

氮源同化測試基礎培養基（BMN）（g/L）：酵母碳源基礎17.9。

碳源同化測試基礎培養基（BMC）（g/L）：酵母氮源基礎10。

YEPD 固體培養基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母粉10，瓊脂20。

維生素基礎固體培養基（g/L）：維生素基礎培養基17，瓊脂20。

1.2 菌株篩選

（1）初篩 將待篩選菌株在YM固體培養基上涂布平板，15℃培養3天，挑取單菌落轉移到羅丹明B 篩選平板上，15℃培養3 天，于350nm 紫外光下觀察。依據培養平板上形成的熒光圈的早晚和熒光圈直徑與菌落直徑比值的大小進行篩選，直徑比大的菌落表明水解脂肪酶能力強。

（2）復篩 將初篩的菌株挑取單菌落接入YM液體培養基，15℃、200r/min搖瓶培養1～2天，以10%接種量接種于發酵培養基，15℃、200r/min 搖瓶發酵3～7 天后，12000r/min 離心20min，取上清液即得粗酶液，測定酶活性。

酶活性測定參考Margesin 等的測定方法并略作修改。取棕櫚酸對硝基苯酯（PNPP）溶液0.3mL（ 體 系 為 0.0378g PNPP、 0.1g 阿 拉 伯 膠、0.4mLTritonX-100溶于50mmol pH7.0的Tris-HCl 緩沖液中，加熱至溶解，定容至100mL），待測酶液0.2mL，充分混合后15℃條件下反應15min，立即取出加入0.5mL無水乙醇終止反應。分別取200μL反應液加入96孔板中，滅活的酶液作為空白對照，測定410nm 下吸光值。1 個酶活性單位定義為：在15℃條件下，脂肪酶水解棕櫚酸對硝基苯酯，每分鐘生成1μmol對硝基苯酚所需酶量，單位以U表示。

1.3 形態和培養特征

菌株NYNU 19160的形態學和培養特征的觀察依據文獻[25]進行。在YM固體培養基平板上劃線，15℃培養4～7天后，觀察菌落形態。在YM液體培養基中，15℃靜置培養3天后，顯微鏡觀察細胞形態。在1%玉米瓊脂培養基中，15℃培養15～20天，定期鏡檢，觀察假菌絲。在YCBS 固體培養基、5%麥芽粉固體培養基和2%玉米瓊脂培養基上，15℃培養2～10周，定期鏡檢，觀察擔孢子。

1.4 生理生化特征

參考文獻[25-26]對菌株NYNU 19160進行生理生化鑒定。除了特別說明外，菌株培養溫度均為15℃。利用杜氏管發酵法進行糖發酵測試，連續2周每天觀察記錄杜氏管中氣泡現象。分別采用BMN 和BMC 培養基對菌株進行饑餓培養，7 天后進行碳源、氮源轉接實驗，觀察記錄15 天內菌株同化或生長情況。設定4～45℃溫度梯度，YEPD固體培養基作為溫度測試培養基。利用維生素基礎固體培養基進行維生素生長測試，配制生長測試培養基進行其他生長測試實驗。

1.5 ITS和26S rDNA序列分析

1.5.1 基因組DNA的提取

挑取單菌落于YM 液體培養基中，15℃、200r/min過夜培養24h，離心棄上清液，收集菌體。提取基因組DNA 操作步驟依據酵母基因組DNA 抽提試劑盒進行。

1.5.2 ITS和26S rDNA PCR擴增和測序

利用引物ITS1（5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′） 和ITS4 （5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′）PCR 擴增ITS 區域序列；利用引物NL1 （5′-TAA GCG GAG GAA AAG-3′） 和NL4（5′-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3′）PCR 擴增26S rDNA D1/D2區域序列。PCR擴增條件：94℃預變性5min，30 個循環（94℃變性40s，55℃退火40s，72℃延伸30s）72℃延伸5min。擴增完成后以1%的瓊脂糖凝膠電泳對產物進行檢測，送到生工生物工程技術服務（上海）有限公司測序。

1.5.3 構建系統發育樹

通過NCBI 中blastn 工具，將測序得到的菌株NYNU 19160 ITS 序列以及26S rDNA D1/D2 區域序列在GeneBank 核酸數據庫中進行序列相似搜索，利用Clustal X軟件按照最大同源性的原則，將親緣關系較近的典型菌株作為參比對象進行比對。利用MEGA 7.0 軟件采用鄰接法構建系統發育樹。選擇1000 次重復取樣進行進化樹拓撲分析，確定進化地位。

1.6 脂肪酶的純化

將發酵液離心取上清液即得粗酶液，在冰水浴及磁力攪拌條件下緩慢加入研磨好的硫酸銨粉末，添 加 至 飽 和 度（20%～100%）， 靜 置30min，10000r/min冷凍離心，取上清液測定酶活性。以上清液中的酶活性對硫酸銨飽和度作圖。根據確定出的硫酸銨飽和度進行分級沉淀，沉淀復溶于PBS（50mmol/L，pH7.0）中，4℃透析12～14h 后進行濃縮，0.22μm 濾膜過濾后，測定酶活性并使用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白含量，計算酶純化倍數和活性回收率。保存純化后的酶液用于后續酶學性質研究。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選

經過羅丹明B 平板初篩，篩選出12 株熒光圈與菌落直徑比值較大的菌株（表1）。通過對上述菌株進行復篩，菌株NYNU 19160產脂肪酶活性較高，達到34.47U/mL。

表1 不同的菌株脂肪酶活性

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態與培養特征

菌株NYNU 19160 在YM 固體培養基中，15℃培養5 天后，菌落呈奶油色，表面光滑且有光澤，具有完整邊緣。在YM 液體培養基15℃靜置培養3天后鏡檢，細胞呈卵圓形（圖1），單個或成對出現，細胞大小為[(3～6)μm×(3～5)μm]，呈極性出芽。在1%玉米瓊脂培養基中15℃培養15～20 天，定期鏡檢，不形成假菌絲。在YCBS 固體培養基、5%麥芽粉固體培養基和2%玉米瓊脂培養基中15℃培養2～10周，定期鏡檢，不形成擔孢子。

圖1 菌株NYNU 19160的細胞形態

2.2.2 生理生化特征

菌株NYNU 19160不發酵糖。可利用乙胺、硝酸鹽、D-色氨酸、亞硝酸鹽、氨基葡萄糖、肌酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、蔗糖、木糖醇、D-麥芽糖、5-酮-D-葡糖糖鹽、水楊苷、L-阿拉伯糖醇，不可利用尸胺、肌酐、L-賴氨酸、L-山梨糖、甲醇、D,L-乳酸，弱同化咪唑、D-阿拉伯糖，延遲同化核糖醇、檸檬酸、乙醇。在維生素基礎固體培養基上可生長。在15～25℃下生長較快，在40～45℃下不生長。在添加0.01%放線菌酮培養基中弱生長，在添加0.1%放線菌酮、1%乙酸培養基中均不可生長（表2）。菌株NYNU 19160形態和生理生化特征與最相近。

表2 菌株NYNU 19160的生理生化特征

2.2.3 ITS和26S rDNA序列分析

擴增菌株NYNU 19160 的ITS 和26S rDNA D1/D2 區域序列，序列長度分別為504 bp 和597 bp。在GeneBank 核酸數據庫中，通過NCBI 中blastn 工具進行比對后，發現菌株NYNU 19160 的ITS 序列與EX F-4087的相似性為100%，26S rDNA D1/D2 區域序列與EX F-4087相似性為99.83%。圖2 為菌株NYNU 19160 與所 構 建 系 統 發育樹。由系統發育樹可以看出，菌株NYNU 19160與EX F-4087聚為一群。結合形態學和生理生化特征，將菌株NYNU 19160鑒定為。

圖2 菌株NYNU 19160 ITS和26S rDNA D1/D2區域序列系統發育樹

2.3 低溫脂肪酶的純化

菌株NYNU19160 硫酸銨沉淀上清液中低溫脂肪酶活性變化曲線表明，飽和度為20%～60%時，酶活性較高，其中飽和度為30%時酶活性最高，為65.6U/mL，隨著硫酸銨飽和度增加到70%，酶活性急劇下降，當飽和度達到90%時，酶活性很低，表明該飽和度下大部分脂肪酶已沉淀（圖3）。因此可選用30%飽和度進行硫酸銨一級沉淀，以除去部分雜質蛋白，選用90%飽和度進行硫酸銨二級沉淀。

圖3 菌株NYNU 19160硫酸銨沉淀上清液中脂肪酶活性變化曲線

經過粗酶液、一級沉淀上清液以及濃縮后酶液的總蛋白質量和總酶活性的計算，得出純化后酶液的比活性為97.93U/mg，純化倍數為2.12，酶活性回收率為33.5%，見表3。

表3 菌株NYNU 19160低溫脂肪酶純化結果

2.4 低溫脂肪酶酶學性質

2.4.1 酶最適反應溫度及溫度對酶穩定性的影響

取純化后的酶液，于0～50℃條件下分別進行酶反應， 測定酶活性。 結果表明， 菌株NYNU19160 所產脂肪酶在20℃條件下酶活性達到最高，0℃仍有12%的相對酶活性，25～35℃條件下相對酶活性在60%以上，證明該酶符合低溫酶的特性（圖4）。將酶液在不同溫度下保溫不同時間后測定剩余酶活性，菌株NYNU19160 脂肪酶在20～30℃條件下酶活性穩定性最好，但熱穩定性較差，在50℃下保溫30min酶活性損失80%（圖5）。

圖4 溫度對低溫脂肪酶活性的影響

圖5 溫度對低溫脂肪酶穩定性的影響

2.4.2 酶最適反應pH及其酸堿穩定性

在最適反應溫度條件下，將純化后的酶液置于不同pH反應體系中，測定酶活性。pH為7～8.5時酶活性達80%以上，最適反應pH為7.5。將酶液在不同pH 緩沖液中保溫處理1h，以原酶活性為100%，測定剩余酶活性。隨著pH增大，酶穩定性逐漸提高，pH 為7～8 時仍存留80%酶活性，pH為4 以下時酶活性幾乎喪失，剩余3.87%，證明菌株NYNU19160脂肪酶在酸性環境中不穩定（圖6）。

圖6 低溫脂肪酶最適反應pH及酸堿穩定性

2.4.3 金屬離子對酶活性的影響

將Mg、Ni、Mn、Ba、Zn、K、Li、Na、Ca、Co、Fe、Cu、Pb、La添加到酶反應體系中，使終濃度為1mmol/L，以未與金屬離子混合的原酶液作為對照，在最適反應條件下反應15min后測定酶活性，考察不同金屬離子對菌株NYNU19160 脂肪酶的影響。由圖7 可知，Co、Cu、La可明顯促進酶活性，其中Cu對酶活性促進作用最為顯著，達到186%，Li可能影響了該酶蛋白構象，明顯抑制了酶活性，使酶活性降低近60%。

圖7 金屬離子對低溫脂肪酶活性的影響

2.4.4 有機溶劑對酶活性的影響

添加一定濃度的有機溶劑可在酶促有機合成應用中起重要作用。由圖8 可以看出，菌株NYNU19160 脂肪酶活性隨著有機溶劑極性減弱而降低。苯與正己烷均對該酶有抑制作用，30%的正己烷在4℃混合1h 酶活性僅剩30%，而乙腈、甲醇、乙酸、異丙醇均對酶活性有促進作用，但濃度增大抑制了酶活性，正丁醇、乙醚、乙醇對酶活性促進作用不明顯。

圖8 不同有機溶劑對低溫脂肪酶的影響

2.4.5 底物特異性

選取不同碳鏈長度的對硝基苯酚酸酯作為底物分別進行酶反應，結果如圖9所示。該脂肪酶對對硝基苯酚丁酸酯（-nitrophenyl butyrate，NPC4）催化活性最大，對對硝基苯酚硬脂酸酯（nitrophenyl Stearate,NPC18）催化活性最小，說明菌株NYNU19160脂肪酶對中短鏈底物具有特異性。

圖9 低溫脂肪酶對不同碳鏈對硝基苯酚酯的水解活性

3 結論

本文從實驗室所保藏的55 株產低溫脂肪酶酵母菌株中篩選出一株高產菌株，對該菌株進行了鑒定，經初步純化后，研究了該酶的酶學性質，結果如下。

（1）通過初篩和復篩獲得一株低溫脂肪酶高產酵母菌株NYNU 19160，通過形態學、生理生化以及ITS和26S rDNA D1/D2區域序列分析，將該菌株鑒定為。

（2）粗酶液通過硫酸銨分級沉淀、透析、濃縮，純化后酶液比活性為97.93U/mg，純化倍數為2.12，酶活性回收率為33.5%。

（3）菌株NYNU 19160 產生的脂肪酶最適反應溫度為20℃，在溫度20～30℃的條件下，酶較穩定，但對熱敏感，在50℃下處理30min僅殘留20%的酶活性；酶的適宜作用pH范圍在6.5～8.5，最適pH 為7.5；Cu對該脂肪酶有顯著的激活作用，而Li顯著抑制了酶活性；該脂肪酶適宜與極性較強且濃度較低的有機溶劑混合反應，如乙腈、甲醇、乙酸等，而苯和正己烷則對酶活性抑制作用較強；對硝基苯酚丁酸酯為該脂肪酶的最適反應底物。

（4）該脂肪酶為典型低溫堿性脂肪酶，在生物質能源、洗滌劑、皮制品、廢水處理等低溫堿性環境中具有廣泛的應用前景。