磁性Fe3O4@SiO2@介孔SiO2空心微球的制備及漆酶固定化

李群艷，孫路瑤，常其飛，周運爐

（北京工業大學材料與制造學部，北京 100124）

生物催化技術的衍生和發展給21世紀的世界經濟帶來了重大發展，其中生物酶是一種對環境友好、高效無毒的催化劑，但是游離態的生物酶穩定性差、易失活、難以回收、重復利用率低。與游離酶相比，酶固定化技術的出現針對這些問題起到了很重要的作用，因而固定化酶技術具有很大的發展潛力。磁性介孔SiO具備介孔構造的同時兼具優異的磁分離回收性能，成為生物酶固定化方向的研究熱點。Xue等通過溶劑熱法和水熱結晶法相結合制備出磁性介孔SiO，這種磁性介孔SiO介孔孔徑為2.98nm，比表面積為404～442m/g，具有高飽和磁化強度，為17.7～33.5emu/g。采用這種微球對脂肪酶進行固定化后，結果表明，游離酶的催化活性遠不如固定化酶分子，且十分容易通過磁體與反應系統分離，重復使用5 次，還能保存高達90%的初始活性。Fu 等通過一步反應制備出磁性介孔SiO微球，這種微球尺寸在200nm左右，包覆的殼層約50nm厚，介孔尺寸為4.2nm，比表面積為548m/g，孔容為0.3cm/g。樣品的飽和磁化強度為42emu/g，在外加磁場下能夠完成樣品的迅速分離。以往的研究表明，SiO材料的內部孔道結構是影響酶固定化性能的主要因素。在近些年的研究報道中，磁性介孔SiO材料的相關合成大多是在堿性環境中進行的，而酸性條件方面還缺乏細致的研究報道。酸性環境可以使硅烷水解反應加快，同時妨礙硅氧烷鍵之間的縮合，只能在聚合物的末端進行反應，可以得到不同微觀結構的介孔SiO材料。本文作者課題組提出以FeO空心微球為基礎，以SiO致密層包覆保護磁性層，然后在酸性環境中再進行介孔SiO層的包覆得到磁性介孔空心復合微球，以十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）為結構導向劑，調控其用量并研究其對空心微球微觀結構的影響，最后研究考察了微球對漆酶的固定化性能以及對比了固定化酶與游離酶在不同pH和溫度下的活性。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗材料

四水合氯化亞鐵和正硅酸乙酯（TEOS）均為分析純，天津市福晨化學試劑廠；氫氟酸、濃氨水和氫氧化鈉均為分析純，北京化工廠；CTAB，分析純，廣東汕頭市隴化工廠；聚環氧乙烷-聚環氧丙烷-聚環氧乙烷三嵌段共聚物（P123）、2,2′-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（ABTS）和漆酶均為分析純，Sigma Aldrich；磷酸鹽緩沖溶液（PBS），自配；37%濃鹽酸，分析純，北京通廣精細化工公司。

1.1.2 分析測試儀器

樣品的晶型結構通過日本島津XRD-7000 型X射線衍射儀（XRD）分析測定；樣品的微觀形貌及殼層厚度通過JEM-2010 型透射電子顯微鏡（TEM，工作電壓為200kV）觀測分析；樣品的比表面積、孔容、孔徑及孔徑分布以及吸附-脫附等溫線是經過Micromeritics ASAP 2020 比表面全自動物理吸附儀測定；固定化酶和游離酶的固定量及其活性采用Thermo Evolution 600 紫外分光光度計監測得到。在室溫下通過Lake Shore VSM-7307 型振動樣品磁強計對空心微球進行磁性能測試。

1.2 實驗方法

首先進行中空β-FeOOH 微球的制備，再以致密的SiO層包覆保護β-FeOOH 磁性層，然后在酸性環境中再進行介孔SiO層的包覆，得到β-FeOOH@SiO@介孔SiO空心復合微球，最后在還原氣氛下進行煅燒得到磁性FeO@SiO@介孔SiO空心復合微球，并研究微球的微觀結構。

1.2.1 中空β-FeOOH微球的制備

首先，將濃度為0.1mol/L 氯化亞鐵溶液和一定量的質量分數40%的氫氟酸混合，使得(F)∶(Fe)=1∶3。通過質量分數為25%的氨水來調節上述混合溶液的pH至4.5。將自制的SiO微球乳液超聲1～2min 以分散，后將SiO微球乳液與上述溶液在60℃水浴環境下攪拌2h，所得樣品為SiO@β-FeOOH 實心微球。使用5%的NaOH 溶液將所制備的SiO@β-FeOOH實心微球去除核心，在40℃下水浴攪拌2h，而后離心、水洗兩次得到中空β-FeOOH微球樣品。對自制的SiO微球以及SiO@β-FeOOH實心微球進行TEM表征，觀察其微觀形貌。

1.2.2 β-FeOOH@致密SiO空心復合微球的制備

將制備完成的β-FeOOH 中空微球與0.05mol/L氨水溶液在35℃下攪拌混合均勻，逐滴加入1.26g正硅酸乙酯（TEOS），水浴攪拌2h 后得到β-FeOOH@致密SiO空心復合微球樣品，并對其進行TEM 表征，觀察其微觀形貌。另外對其進行了酸性條件下的溶解性實驗，將所制備的微球在2mol/L鹽酸溶液中浸泡24h，并對其進行TEM表征，觀察β-FeOOH 中空微球表面致密的SiO層厚度和β-FeOOH納米棒腐蝕情況。

1.2.3 β-FeOOH@SiO@介孔SiO空心復合微球的制備

將0.40g 聚環氧乙烷-聚環氧丙烷-聚環氧乙烷三嵌段共聚物（P123）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）和0.50g KCl置于30mL鹽酸溶液中，攪拌使得P123 充分溶解。CTAB 加入量分別為0、0.009mol/L、0.014mol/L，所對應的樣品名為K0、K1、K2。將P123 溶液、15mL 鹽酸、β-FeOOH@致密SiO空心微球混合攪拌10min，緩慢滴加1.26g TEOS，40℃下水浴24h。然后離心，醇洗、水洗各三次，在50℃烘箱中干燥后得到β-FeOOH@SiO@介孔SiO空心復合微球樣品，并對其進行TEM表征，觀察其微觀形貌。

1.2.4 FeO@SiO@介孔SiO空心復合微球的制備

干燥完成后，通過馬弗爐煅燒去除空心微球的模板劑，在500℃下保溫5h，升溫速率為1℃/min。最后，將樣品在還原氛圍（95%Ar，5%H）中煅燒，溫度為350℃，保溫3h，升溫速率為1℃/min，得到FeO@SiO@介孔SiO空心復合微球樣品，并對所制備微球進行了TEM、XRD 表征，分析其微觀形貌及晶體結構，同時對其進行了磁性能測試以及孔結構的表征。

1.3 漆酶固定化實驗

將0.01g的空心FeO@SiO@介孔SiO復合微球樣品加入到配制好的濃度為1mg/mL的漆酶溶液中，磁力攪拌2h后離心分離樣品，分別取三次上清液，測得固定化前后漆酶溶液在波長為276nm處的吸光度，再通過標準曲線計算得到漆酶溶液濃度。通過固定化前后漆酶溶液濃度的差值，利用式(1)計算得到在一定的時間內空心復合微球載體對漆酶的固定量，并計算三次結果的平均值。最后在50℃下干燥，所得樣品為固定化漆酶。2,2′-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（ABTS）是一種常用來測定漆酶活性的介體，可以被漆酶氧化，且氧化后其特征吸收峰位于420nm。因此，漆酶的活性可以利用紫外-可見光分光光度計在波長為420nm 處測定氧化型ABTS的吸光度。監測固定化酶、游離酶的酶活性：將二者分別加入到8mL 不同pH 的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中，然后再分別加入1mL濃度為2mmol/L 的ABTS 溶液、1mL 濃度為0.01mol/L的HO溶液，室溫下進行10min振蕩反應，在冰水浴中終止反應，然后監測ABTS 在420nm 處反應前后吸光度的變化，最后得到FeO@SiO@介孔SiO空心復合微球固定化酶和游離酶的活性并進行對比。

式中，q為漆酶在時刻的吸附量，mg/g；為漆酶的初始濃度，mg/mL；c為時刻漆酶的剩余酶濃度，mg/mL；為溶液的總體積，L；為載體材料的質量，g。

2 結果與討論

2.1 空心復合微球的微觀結構

圖1 是幾種微球的微觀結構TEM 照片。圖1(a)是自制的單分散SiO微球，能夠看到微球的尺寸均勻，分散平均，其平均尺寸約為315nm。圖1(b)是β-FeOOH 包覆在單分散的SiO微球后得到的SiO@β-FeOOH 實心微球，β-FeOOH 納米棒在單分散的SiO微球表面互相搭接成三維網絡結構，并且包覆均勻，單個β-FeOOH 納米棒平均長度約為37nm，平均直徑約為9nm，β-FeOOH 殼層平均厚度約為48nm。圖1(c)是β-FeOOH@SiO中空微球的TEM 照片，能夠看到其表面包覆了一層均勻致密的SiO，致密層平均厚度約為6nm，具有完整的球形結構。圖1(d)是樣品在2mol/L 鹽酸條件下浸泡24h后的β-FeOOH@SiO空心微球的TEM照片，可以看到致密SiO層厚度也無明顯變化，納米棒未被腐蝕，樣品的球形度依然良好，說明SiO致密層表現出隔離保護的作用，使納米棒與鹽酸不接觸，阻止納米棒被腐蝕。圖1(e)為β-FeOOH@SiO@介孔SiO空心微球的TEM 照片，球仍具有較好的球形度，介孔層平均厚度約為11nm。再次煅燒，得到FeO@SiO@介孔SiO空心微球[圖1(f)]。

圖1 空心復合微球的微觀結構

圖2 為還原氣氛焙燒后的β-FeOOH@SiO@介孔SiO空心復合微球的XRD 圖。已制備出的介孔SiO@SiO@FeO空心微球繼續在還原氣氛中于350℃下焙燒3h，微球中的α-FeO被還原成FeO，然后得到磁性FeO@SiO@介孔SiO空心復合微球。還原后樣品所測的XRD 數據見圖2，對比FeO晶型（PDF#19-0629），可以看出圖中FeO的(220)、(311)等衍射峰與FeO晶型PDF 各衍射峰位基本一致，并且在20°～30°出現了無定形的SiO衍射峰，并沒有出現其他的衍射峰，表明具有純的FeO晶相，并不含有其他的任何雜相，說明空心復合微球的FeO磁性層被很好地制備。

圖2 還原氣氛焙燒后的β-FeOOH@SiO2@介孔SiO2空心復合微球的XRD圖

圖3 為FeO@SiO@介孔SiO空心復合微球樣品在室溫下的磁滯回線和磁分離效果圖。微球的飽和磁化強度為11.3emu/g，矯頑力為111.5Oe，從局部放大圖可以看出中心區域的樣品沒有完全重合，這表明具有一定的矯頑力。分散后的樣品可以利用磁鐵在容器一側迅速富集，移除磁鐵后也可以迅速再分散，表明樣品的再分散性良好，可以重復利用。

圖3 Fe3O4@SiO2@介孔SiO2空心復合微球的磁滯回線和磁分離效果圖

圖4 為在不同CTAB 添加量的條件下所制備的FeO@SiO@介孔SiO空心復合微球的N吸附-脫附等溫線以及孔徑分布圖。從圖4 觀察得出，4 條等溫線都是標準的第Ⅳ類等溫線，說明輔助模板劑CTAB 的加入并不會改變復合微球的介孔結構。相對壓力/極低時，N吸附量急劇增加，是微孔填充的現象，微孔的存在導致吸附作用力加強。在/=0～0.2時，經過前期的急劇上升階段后，此時氮氣分子逐漸吸附到樣品介孔內表面，N吸附量上升緩慢。在/=0.4～0.7 時，出現一個H1 型滯后環，H1 型滯后環的產生表明新型介孔材料的孔徑分布較窄，孔徑尺寸相對較小。此外滯后環坡度越大，樣品的孔徑分布越窄，孔徑尺寸大小越均一。所制備的FeO@SiO@介孔SiO空心復合微球的比表面積、孔容都隨著所加入CTAB的增加而增加，具體數據如表1所示。原因在于兩模板劑復合后體積變大，使得FeO@SiO@介孔SiO空心復合微球的比表面積以及孔容增加。微球的孔徑分布圖顯示其樣品的孔徑分布在3.21nm 左右且分布范圍較窄，微球樣品的介孔孔徑隨著輔助模板劑CTAB 量的增加，最可幾孔徑分布在逐步減小，孔徑范圍由4.30nm減小到3.19nm。原因是輔助模板劑CTAB的分子尺寸要小于P123的分子尺寸，所以CTAB量的增多會導致空心微球最可幾孔徑減小。

圖4 在不同CTAB量條件下制備的Fe3O4@SiO2@介孔SiO2空心復合微球的N2吸附-脫附等溫曲線及孔徑分布圖

表1 在不同CTAB量條件下Fe3O4@SiO2@介孔SiO2空心微球的孔結構參數

2.2 空心復合微球的酶固定化性能

使用所制備的FeO@SiO@介孔SiO空心復合微球樣品K0、K1、K2分別對漆酶進行固定化，然后測得樣品在不同時間條件下對漆酶的固定量如圖5所示。由圖5可得，在前2h內，對漆酶的吸附處于初始階段，空心復合微球的吸附速率會十分迅速，而隨著時間增加，空心復合微球樣品對漆酶的吸附量逐漸趨于飽和，8h后空心復合微球樣品K0、K1、K2 對漆酶的飽和固定量分別是234mg/g、190mg/g、185mg/g。在不同條件下制備的介孔SiO@SiO@FeO空心復合微球的樣品中，樣品K0的漆酶固定量最高，而且在樣品K0、K1、K2中漆酶固定量依次降低。這主要是因為樣品K0 的最可幾孔徑最大，酶分子更容易進入孔道中。

圖5 不同Fe3O4@SiO2@介孔SiO2空心微球對漆酶的固定量隨時間的變化

漆酶分子的尺寸大約在7nm×5nm×5nm，而隨著空心復合微球樣品K0、K1、K2的最可幾孔徑依次降低，其對于漆酶的固定化能力也相應降低，因此酶分子尺寸與酶固定化載體孔徑之間的匹配十分重要。介孔孔徑過小會導致酶分子無法進入孔道或在孔道中堵塞，孔徑過大則會導致酶分子從孔道中脫落。這說明載體孔徑與酶分子尺寸之間的匹配是影響酶固定化性能的一個十分重要的因素。圖6為漆酶分子在不同尺寸孔徑的FeO@SiO@介孔SiO空心微球中移動方向。從圖6可以看出，酶分子在過小尺寸的孔道中容易發生堵塞，在過大尺寸的孔道中容易出現泄漏。為了達到最佳的酶固定化性能，需要選擇合適介孔尺寸的載體材料。

圖6 漆酶分子在不同尺寸孔徑的Fe3O4@SiO2@介孔SiO2空心微球中移動方向

圖7 為FeO@SiO@介孔SiO空心復合微球固定化漆酶和游離漆酶的相對活性。從圖7(a)可以看到，隨著pH由3變到7，固定化酶的酶活性都顯著高于游離酶，并且固定化酶的相對活性變動不大，游離酶變化較明顯，表明固定化酶在不同pH 下的穩定性更高；pH=4 時，游離酶與固定化酶活性均最高。當pH=7 時，游離的漆酶與固定化酶的活性分別為8%和57%，這說明固定化漆酶對于酸堿環境的耐受力顯然遠強于游離酶。使用微球作為載體進行漆酶的固定化時，此時載體對漆酶分子提供一個保護層，同時空心復合微球的表面上含有大量硅羥基，在接觸到酸性離子時會對pH 的變化起到一個緩沖作用，因此固定化酶在不同pH 下的穩定性更高。從圖7(b)可以看到兩者對溫度變化表現出的環境抵抗力有明顯差異，顯然固定化酶相對催化活性更高。在30℃下固定化漆酶和游離酶都保持著較良好的催化活性，固定化酶的酶活性為93%。酶分子對于環境溫度十分敏感，在非最佳反應溫度下難以保持良好的催化活性。在實驗條件達到70℃時，游離酶的相對活性只剩8%，酶分子大量失活，而固定化酶還能保持35%左右的酶活性。這表明，以FeO@SiO@介孔SiO空心復合微球作為載體進行酶固定化可以使酶分子具有更高的催化活性。在極端的溫度和酸堿環境下，固定化酶分子的催化活性都顯著優于游離酶。

圖7 Fe3O4@SiO2@介孔SiO2空心復合微球固定化漆酶和游離漆酶的相對活性

3 結論

（1）以致密層SiO作為保護層，在酸性環境下成功得到磁性介孔中空復合微球，微球具有規整的球形結構，通過改變CTAB 的量能夠調控介孔孔徑，孔徑變化范圍在3.19～4.30nm，比表面積變化范圍為376～640m/g。

（2） 空心復合微球的飽和磁化強度為11.3emu/g，矯頑力為111.5Oe，在外加磁場作用下可以快速實現樣品的快速分離，且樣品的再分散性良好。

（3）當介孔孔徑為4.30nm 時，空心復合微球對漆酶的固定量高達234mg/g，以復合微球作為載體進行酶固定化可以使酶分子具有更高的催化活性，而且固定化漆酶在不同pH 和溫度下的催化活性遠高于游離酶分子。

（4）載體孔徑與酶分子尺寸之間的匹配是影響酶固定化性能的一個十分重要的因素。在未來的研究工作中，可以通過使用擴孔劑代替CTAB來實現載體較大范圍孔徑的調節，以實現良好的酶固定化效果。