絲瓜絡固定化米根霉催化光皮樹油制備生物柴油

紀淑蘭，李迅，王飛

（南京林業大學化學工程學院，江蘇 南京 210037）

生物柴油（脂肪酸甲酯）作為一種清潔的柴油燃料，有望成為傳統化石燃料的替代品。目前制備生物柴油的主要方法為化學法，但化學法存在能耗高、產品純化復雜、對環境造成二次污染等缺點。生物法制備生物柴油不需要額外去除催化劑和鹽，純化費用低，具有很大的應用潛力，然而目前生物法中催化劑的高成本一直被認為是生物法制備生物柴油產業化的一個重要障礙，利用固定化全細胞作為生物催化劑可以避免脂肪酶的復雜純化過程，有效降低生物催化劑的制備成本。全細胞催化劑具有更高的醇耐受性和熱穩定性，具有更長的使用壽命，能有效降低生物柴油的催化劑使用成本，越來越受到人們的重視。

米根霉在工業上是糖化酶、淀粉酶和乳酸脫氫酶產生菌種，在適宜的培養條件下米根霉還可產生大量的脂肪酶，目前固定化米根霉在制備生物柴油中已取得了一定的研究進展。Ban 等將米根霉細胞固定在聚氨酯泡沫顆粒體上，催化大豆油甲酯化制備生物柴油。Athalye 等以聚乙烯塑料為載體，固定化米根霉，以此催化棉籽油制備生物柴油，脂肪酸甲酯（FAME）產率為27.9%（228.2g/L）。利用高分子產品（如聚氨酯和聚乙烯等）作為固定化材料，在細胞固定化中會遇到一系列問題，如載體穩定性欠佳和成本較高；合成聚合物的毒性和機械強度不足，從而會引起細胞破裂和酶活性下降，缺乏細胞生長所需的足夠空間等。生物基材料除了具備作為細胞固定化載體材料的特質之外，還具有物豐價廉、無毒害、可生物降解、生物相容性好等優點，可以解決全細胞法制備生物柴油中細胞固定化載體的后期處理問題，在理論上有很好的應用前景。

原料來源是限制生物柴油產業發展的又一瓶頸，我國人口多，人均占有耕地面積較少，選擇植物原料油應注意不能違背國家發展可再生能源“不與農征地，不與人爭食”的方針，開發一些非食用植物油作為生物柴油的原料是一個重要方向。光皮樹的壽命可達200 年以上，平均每株光皮樹產油15kg/a，其果實所含脂肪酸組分優于菜籽油，主要為油酸、亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸和亞麻酸等，適合用來制備生物柴油。本研究選用光皮樹油作為原料，考察不同的廉價生物基固定化材料固定化米根霉制備全細胞催化劑，并探討固定化全細胞催化光皮樹油生產生物柴油的適宜條件。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 實驗材料

米根霉LY6由本實驗室保存；絲瓜絡海綿，中國鎮江洛康公司；胰蛋白胨、酵母提取物等，Oxoid（Hampshire，England）公司；系列脂肪酸甲酯標準品（色譜級），Sigma 公司，以上試劑均為分析純；光皮樹油由湖南林科院饋贈。

1.1.2 培養基

采用液體搖瓶培養，探討培養基碳源、氮源培養條件對米根霉產脂肪酶及轉酯化的影響?；A培養基中含有7%的多聚蛋白胨、0.1%的NaNO、0.1%的KHPO、0.05%的MgSO·7H0 和3%的橄欖油。

1.1.3 主要儀器

低溫液相層析柜，德國Thermo 公司；氣相色譜儀，美國Aglilent公司；離心機，德國Eppendorf公司；超凈工作臺，蘇州安泰技術有限公司；恒溫培養振蕩器，上海知楚有限公司。

1.2 米根霉細胞的固定化

將預處理的固定化材料稱取一定量加到裝有100mL 液體發酵培養基的250mL 搖瓶中，于121℃高壓蒸汽滅菌20min，冷卻至室溫后，接種約10個米根霉孢子，在28℃、180r/min 條件下搖瓶培養，過濾分離得到固定化全細胞，用去離子水洗滌數次，于-20℃下預冷凍24h，然后置于-40℃下真空冷凍干燥24h，取出后稱重，計算固載率。將樣品置于4℃冰箱內保存備用。本文所涉及實驗均重復3次，誤差線為標準偏差的平均值。固定細胞干重按式(1)計算，固載率按式(2)計算。

1.3 固定化米根霉全細胞催化劑的交聯劑處理

將催化劑置入裝有100mL 0.1%交聯劑溶液的250mL 搖瓶中，在25℃、180r/min 搖床內反應1h，過濾，用去離子水洗滌催化劑數次，再置入裝有100mL 磷酸緩沖液（0.1mol/L，pH 6.8）的250mL搖瓶中，于4℃保溫5min，通過過濾固液分離后，用去離子水洗滌催化劑數次，于-20℃下預冷凍24h，然后置于-40℃下真空冷凍干燥24h。將樣品置于4℃冰箱內保存備用。

1.4 固定化米根霉全細胞催化光皮樹油甲酯化反應

在25mL 茄形瓶中，加入4.825g 光皮樹油和一定量的磷酸緩沖液（0.1mol/L，pH6.8）作反應溶劑，再加入一定量的固定化全細胞催化劑，按醇油摩爾比1∶1在反應0h、10h、24h、48h時各添加一次甲醇，于35℃、180r/min 條件下反應一定時間，定期取100μL 反應液進行氣相色譜分析。反應過后，過濾固液分離得到催化劑，用蒸餾水和正己烷洗滌數次，室溫干燥1天后重復使用。

1.5 甲酯化產物分析

采用內標法測定甲酯得率[式(3)]。反應結束后，離心取上層產物，用正己烷稀釋成一定濃度，加入一定濃度的內標物（十七烷酸甲酯，正己烷配制），混勻后進行氣相色譜（GC，Aglilent 7890A）分析。分析條件為：PEG-20M極性毛細管柱，FID檢測器，載氣為高純氮氣，流速為30mL/min。進樣量1μL，分流比50∶1，進樣口和檢測器溫度分別設為250℃和260℃，初始溫度180℃，保溫2min，然后以3℃/min升至240℃，保溫10min。

圖1為絲瓜絡固定化米根霉全細胞催化光皮樹油甲酯化反應的氣相色譜圖。各甲酯的種類及含量和光皮樹油中的脂肪酸組成一致。

圖1 固定化米根霉催化光皮樹油的產物氣相色譜圖

2 結果與討論

2.1 米根霉固定化條件的優化

2.1.1 固定化材料對米根霉固定化的影響

在相同培養條件下，選用絲瓜絡、納米纖維、水凝膠、椰殼活性炭作為固定化材料，研究不同生物基材料對米根霉固定化的影響。由圖2 可看出，水凝膠與納米纖維的固載率極低，分析是由于其孔隙為納米級，能進入并被固定化的米根霉菌絲量較少，因此兩種材料并不適于絲狀真菌米根霉的固定化?；钚蕴吭谌毎潭ɑ缃湍敢约懊傅墓潭ɑ卸加泻芏鄨蟮?，但是在本實驗中，椰殼活性炭的固載率也較低，原因為活性炭的吸附機理是依賴于分子之間相互吸附的“范德華力”或依靠自身獨特的孔隙結構，在固定化米根霉過程中，活性炭的孔徑大約1.5nm，而米根霉的孢子囊直徑60～250mm，所以椰殼活性炭固定化的菌體只是纏繞在其表面的一層，并沒有發揮其吸附作用，后續甲酯化反應發現椰殼活性炭固定的菌絲容易在震蕩過程中發生脫落現象。相比于納米纖維、水凝膠和椰殼活性炭，絲瓜絡的固載率達162%以上，甲酯得率更是90%以上，原因為絲瓜絡是一種具有三維立體網狀結構的多孔性生物質材料,氣通量高達63546L/(m·s)，孔隙率達79%～93%，BET（Brunauer-Emmertt-Teller equation）比表面積平均值可達123m/g，本研究采用的絲瓜絡孔徑為2～4mm，主要成分是木質纖維素，具有良好的生物親和性，有利于根霉菌絲的黏附生長，在后續反應中也證實固定的菌絲不易脫落。納米纖維、水凝膠和椰殼活性炭固定化米根霉不但固載率低，而且由于細胞只是纏繞在材料表面，在后續甲酯化反應過程中菌體脫落，甲酯得率也極低，所以不適于米根霉的固定化實驗。接下來的實驗都用絲瓜絡作為固定化材料。

圖2 不同固定化材料對米根霉固定化的影響

2.1.2 載體添加量對米根霉固定化的影響

絲瓜絡的孔隙發達，能夠為細胞的黏附生長提供充足的空間。為了研究在發酵過程中載體添加量對米根霉細胞固定化的影響，在發酵培養基中添加不同量的絲瓜絡。由圖3可知，隨著絲瓜絡添加量的增加，固載率開始逐漸增加，當每100mL 發酵液載體添加量為2.25g 時，固載率達到最高。當載體添加量較少時（小于2.25g），培養基中有較多的菌絲球，說明載體量不夠。而當載體添加量為2.25g時，固載率達到最高，達到163%，且得到的固定化催化劑催化光皮樹油甲酯得率最高，達到91%。說明在固定化培養過程中，適宜的載體添加量可以使米根霉菌絲幾乎全部固定在載體上，米根霉細胞優先貼附于絲瓜絡載體生長，進一步驗證了絲瓜絡具有良好的生物親和性，同時獲得的固定化細胞催化能力最強，獲得的生物柴油量最多。但是菌體的生長量主要受到培養基成分的限制，當營養物質保持恒定時，菌體的生長量也是一定的，因此當載體添加量過多時（大于2.25g），單位載體的固載量明顯下降，且得到的固定化催化劑催化光皮樹油甲酯得率還有所下降，僅為88%（2.5g載體添加量）。所以基于以上原因，在固定化米根霉培養過程中，以每100mL 發酵液添加2.25g 絲瓜絡為最佳。

圖3 絲瓜絡添加時間對細胞固定化的影響

2.1.3 固定化時間對全細胞催化劑的影響

固定化時間影響載體對細胞的固載率和全細胞催化劑的催化效率，為獲得最經濟的高固載率和高催化活性的固定化全細胞催化劑，本實驗在載體加入24～96h 后分別取樣，探究固定化時間對全細胞催化劑的影響。結果如圖4所示，在米根霉加入固定化載體培養36h之后，固載率保持在163%左右，繼續增加培養時間，固載率沒有太大變化，而加入固定化載體培養到96h，固載率卻有所下降。分析其原因，是由米根霉的生長期決定的，細胞接種后，24～36h 進入快速生長期，48～84h 進入穩定期，84h后培養基中的營養物質耗盡，代謝廢物含量呈上升趨勢，細胞的增殖和細胞胞內脂肪酶的合成受阻。結合固定化全細胞催化劑的甲酯化效果，隨著固定化時間的增加，全細胞催化劑催化效果也呈增長趨勢，甲酯得率在72h 達到最高，為90%。繼續增加固定化時間，甲酯得率反而出現下降趨勢。因此，加入固定化載體絲瓜絡培養米根霉72h時即可收獲高固載率、高催化活性的固定化全細胞催化劑。究其原因，同樣是由米根霉的生長期和產酶期決定的，72h的細胞處于生長穩定期，產酶量達最高，催化效率也是最高的。

圖4 絲瓜絡添加時間對細胞固定化的影響

2.1.4 培養基成分對米根霉固定化的影響

2.1.4.1 不同碳源對米根霉固定化的影響

不同的碳源對細胞生長和脂肪酶產生的影響不同，現有研究表明，以葡萄糖為碳源培養米根霉可以獲得更多的細胞生物量，但檢測到的脂肪酶活性很少，而用植物油，如橄欖油作為碳源，可以觀察到更高的脂肪酶活性。為了獲得更多的細胞生物量和脂肪酶活性，也有人提出將葡萄糖和油脂結合作為碳源。甚至有報道稱碳源不僅影響脂肪酶的產生，而且對細胞壁的組成也有一定的影響，進而影響全細胞催化生產生物柴油的效率。本實驗選用葡萄糖、橄欖油、50%葡萄糖和50%橄欖油的組合、大豆油、糊精、淀粉作為碳源（加入量均為3%），探究不同碳源對米根霉固定化細胞的影響。由圖5可知，葡萄糖、糊精和淀粉作為碳源時，菌體生長較少，在相同的培養時間內，固載率較低，導致后期用相同質量的催化劑做甲酯化反應時，甲酯得率不高，因此在本研究中不適宜作為培養米根霉的碳源。大豆油與橄欖油相比，不飽和脂肪酸含量較低，而培養基含有較多不飽和脂肪酸是提高脂肪酶活性的一種重要方法。橄欖油作為碳源時，固載率較高，且在獲得的全細胞催化劑制備生物柴油的甲酯得率達到90%以上，見圖6。因此，選擇3%橄欖油作為誘導米根霉產脂肪酶的碳源。

圖5 碳源對米根霉固載率的影響

圖6 碳源對米根霉全細胞催化劑催化光皮樹油制備生物柴油的影響

2.1.4.2 不同氮源對米根霉固定化的影響

不同氮源對微生物的生長和酶的性質也有著不同的影響。幾種有機氮源（胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏）和無機氮源（NaNO）對米根霉生長的影響見圖7。結果表明，單純以NaNO為氮源時，米根霉基本不生長。多聚蛋白胨作為氮源時，固載率最高，可達160.7%，且以此獲得的固定化全細胞催化油脂的甲酯化效果也最好，見圖8。牛肉膏作為氮源的全細胞固載率達到154.2%，但是催化劑甲酯化效果相對較差。酵母膏則相反，催化劑甲酯化效果較好，但是全細胞固載率相對于胰蛋白胨較低。胰蛋白胨的全細胞固載率和甲酯化效果在這幾種有機氮源中都處于中間水平。各種研究和生產實踐表明，復合氮源對微生物發酵和產酶比單一無機氮和有機氮更有效，所以結合對米根霉細胞生長和后期轉酯化的效果，選擇多聚蛋白胨作為米根霉產酶的有機氮源，NaNO為無機氮源。

圖7 氮源對米根霉固載率的影響

圖8 氮源對米根霉全細胞催化劑催化光皮樹油制備生物柴油的影響

2.1.5 交聯劑對米根霉固定化的影響

為提高全細胞催化劑的催化穩定性和重復使用性，以此降低生產成本并提高生產效率，研究了不同交聯劑對全制備細胞催化劑的影響。將固定化米根霉細胞分別用0.1% 戊二醛、雙醛淀粉、京尼平溶液進行交聯處理。如圖9所示，未經交聯劑處理的全細胞催化劑在第6批反應的甲酯得率僅為66%，相比較之下，經交聯劑處理后的全細胞催化劑在第6批反應的甲酯化得率均高于未交聯處理的全細胞催化劑，特別是經戊二醛交聯處理的全細胞催化劑，在第6批反應的甲酯化得率能保持在80%以上，戊二醛處理使催化劑穩定性提高歸因于較少的脂肪酶從固定化細胞中泄漏。用戊二醛處理的全細胞催化劑，無論是分子內交聯結構還是分子間交聯結構都比較穩定。雙醛淀粉雖然比戊二醛有更多醛基，但交聯效果比戊二醛稍差，這是因為：一方面，雙醛淀粉的分子量大，空間位阻明顯；另一方面，雙醛淀粉中兩個醛基的距離近，其內部會發生交聯，具有反應活性的醛基含量要比真實的醛基含量少些。且雙醛淀粉的生產成本高，不適于工業化使用。京尼平是梔子苷經-葡萄糖苷酶水解后的產物，分子式為CHO，化學結構具有羥基、羧基等多個活性基團，具有自發與氨基酸或蛋白質反應的能力。然而京尼平的交聯反應機理尚不明確，根據反應觀察和檢測推測認為京尼平自發與氨基酸反應生成一個環烯醚萜的氮化物，再經過一個脫水作用形成一個芳香族單體，最后該單體可能由于自由基反應的二聚作用而形成環狀的分子間和分子內交聯結構。與其他交聯劑相比，京尼平的最大優勢在于其極低的細胞毒性，但是在本實驗中，京尼平交聯處理的全細胞催化劑效果一般，且其價格更昂貴，因此選擇戊二醛為米根霉全細胞催化劑的交聯劑。

圖9 （未）經不同交聯劑交聯處理的全細胞催化劑的重復使用次數

2.2 米根霉全細胞催化劑催化光皮樹油制備生物柴油條件優化

2.2.1 溫度對生物柴油得率的影響

溫度是影響脂肪酶催化反應的一個重要參數，與一般化學反應一樣，提高溫度可以增加酶促反應的速度，而酶是一種活性蛋白質，在化學鍵的維持下具有高度的立體結構，溫度過高將導致化學鍵的斷裂，引起蛋白質變性，從而導致酶的失活。因此，每一種脂肪酶都有自身的最適反應溫度。如圖10 所示，當溫度從25℃逐漸升高時，米根霉全細胞催化劑的轉酯化效果越來越好，在35℃時甲酯得率達到最大值，進一步升高反應溫度，導致脂肪酶蛋白變性，甲酯得率下降，說明米根霉全細胞催化劑的最適催化溫度為35℃。

圖10 溫度對全細胞催化光皮樹油甲醇分解的影響

2.2.2 含水量對生物柴油得率的影響

脂肪酶催化反應主要發生在油水界面上，適當的含水量可以為脂肪酶反應提供反應場所，進而提高甲酯化產率；此外，甲醇是一種親水化合物，易溶于水，適當的含水量可以防止甲醇對整個細胞的抑制。如圖11所示，當反應的含水量從0逐漸提高時，甲酯得率也迅速上升，在10%時達到最高，隨后進一步提高含水量到15%時，甲酯化得率反而下降。因為在脂肪酶生物催化體系中，酯化反應是一個可逆過程，水是油脂酯化反應第二步酯化反應的副產物，過多的含水量會阻礙反應向正向進行，從而降低甲酯化產率。此外，大量的水會阻礙傳質，從而降低反應效率。所以，含水量以10%最為適宜。

圖11 含水量對全細胞催化光皮樹油甲醇分解的影響

2.2.3 催化劑用量對生物柴油得率的影響

在含水率10%（占油重）的反應體系中，分別加入占光皮樹油重8%、10%、12%、15%和18%的全細胞催化劑，對催化劑的用量進行了探索。在反應體系一定的情況下，隨著催化劑用量的增加，反應速率和最終甲酯化得率均有所提升，但是在增加到一定量之后，過多的催化劑不僅不利于反應的進行，反而會因為過多的催化劑影響反應的傳質傳熱，造成催化效率的下降，所以圖12的結果表明，全細胞催化劑用量以12%最佳，甲酯得率可達94%以上。

圖12 催化劑量對全細胞催化光皮樹油甲醇分解的影響

2.2.4 甲醇添加時間對生物柴油得率的影響

本研究中甲醇與光皮樹油的總摩爾比為4∶1，因為甲醇對酶有抑制作用，所以添加甲醇的方式必須考慮避免這種抑制作用。分步加入甲醇已被廣泛用于防止甲醇對酶活性的抑制，并被證明是成功的方法。本研究通過優化甲醇分步加入方式，不僅獲得了更高轉化率的生物柴油，而且有效縮短了催化時間。

先前的研究結果表明，在反應0h、12h、24h、48h時添加甲醇，生物柴油的初始轉化率和最終轉化率較佳，72h 的甲酯得率達90%以上。以此為基礎設計了不同的甲醇添加時間，如圖13 所示，每隔12h 和10h 添加甲醇，反應60h 后的最終轉化率分別為75.6%和72.5%，說明簡單縮短添加甲醇時間間隔會導致甲醇過量累積。根據甲酯化時間曲線，發現36h后甲酯得率增長趨勢放緩，所以進一步改進添加甲醇的時間間隔分別為0h、10h、24h、48h 和0h、10h、20h、48h 和0h、10h、24h、40h，反應60h最高甲酯化得率分別為85.5%、94.15%和84.8%。因此，最佳的添加甲醇方式是以醇油摩爾比4∶1，等摩爾的甲醇分別在0h、10h、24h、40h時添加，不僅獲得了最高的甲酯化得率，且把催化時間由72h縮短為52h。

圖13 甲醇添加時間對全細胞催化劑催化光皮樹油甲酯得率的影響

3 結論

嘗試絲瓜絡、納米纖維、水凝膠、椰殼活性炭生物基材料作為米根霉的固定化材料，通過比較其固載率和甲酯化效果，選定絲瓜絡作為米根霉的最適宜固定化材料，其固載率達到162%±6%。絲瓜絡是一種天然高分子材料，不但具有高孔隙率（79%～93%）和低密度（0.02～0.04g/cm）的纖維血管網狀結構利于米根霉菌絲的黏附，而且具有優良的力學性能和堅韌的質地，可以在后期應用過程中承受較大的剪切力。在100mL 米根霉發酵培養基中加入2.25g 絲瓜絡作為固定化載體，培養72h 即可收獲效果最佳的固定化米根霉全細胞催化劑。為了提高絲瓜絡固定化米根霉的催化效率，研究了培養基成分對其影響。橄欖油含有較多的不飽和脂肪酸，作為碳源具有一定的誘導作用，可有效提高米根霉中的脂肪酶表達量，以此獲得的固定化米根霉催化光皮樹油的甲酯得率達到93%以上。通過評價固載率和甲酯得率，選擇多聚蛋白胨為有機氮源、NaNO為無機氮源的復合氮源來培養及固定化米根霉細胞。同時為了提高固定化細胞的使用壽命和重復使用次數，研究了用質量分數為0.1%的戊二醛、雙醛淀粉、京尼平溶液進行交聯處理的可行性。結果發現，在戊二醛處理的固定化細胞中脂肪酶活性損失較少，在重復使用6次后，轉酯化效果依然保持在80%以上。本研究獲得的全細胞催化劑具有制備簡單、穩定性良好、可重復利用等優點，通過優化的培養基組成也具有價格較低廉的特點，有效控制了全細胞催化劑的制備成本。有關全細胞催化劑的后續工作將圍繞絲瓜絡的改性及機理研究，通過探討其表面基團、粒徑、比表面積、孔徑和機械強度等參數和催化性能的比較，進一步提升全細胞催化劑的催化性能和穩定性，加大其在生物柴油的工業化應用潛力。

米根霉脂肪酶催化的油脂轉酯化生產生物柴油過程中的?；w移，發現隨著水含量在一定范圍內的增加，可以促進酰基轉移，并以此可有效提高生物柴油的產量。當反應體系中含水量是光皮樹油質量的10%、催化劑用量是12%時，最終催化光皮樹油的甲酯得率達到94%以上。此外，甲醇對脂肪酶的抑制也是限制生物柴油得率的原因之一，本實驗嘗試了不同的甲醇添加方式，發現以總醇油摩爾比4∶1，在反應0h、10h、24h、40h 時逐步添加，能在52h獲得85%以上的甲酯得率，有效縮短了催化時間。與現有文獻報道中用米根霉脂肪酶法制備生物柴油相比，本文研究結果在簡化催化劑制備操作步驟、降低其制備成本之外，更是進一步提高了催化效率，縮短了反應時間。而且在后期使用過程中，絲瓜絡固定化米根霉更容易從反應混合物中分離出來以重復使用。有關利用全細胞催化劑制備生物柴油的后續工作將繼續圍繞縮短催化時間進行研究，通過篩選耐甲醇米根霉、混合菌催化和優化反應器等方法，進一步提升全細胞催化劑在生物柴油的工業化應用潛力。