獼猴桃果酒生香酵母的誘變選育及其發酵條件優化

魯云風，張四普，張征田，牛佳佳，楊永鋒

（1.南陽師范學院生命科學與農業工程學院，河南 南陽 473061；2.河南農業科學院園藝所，河南 鄭州 450002；3.河南伏牛山生物科技股份有限公司，河南 南陽 474350）

獼猴桃含有豐富的氨基酸、VC、鈣等物質，具有很高的營養及保健價值[1-2]。獼猴桃果酒以獼猴桃果實為原料，經酵母等微生物發酵而成，風味獨特，深受人們的喜愛[3-4]。但由于目前使用的酵母基本是針對葡萄酒的生產工藝特點而開發出來的釀酒活性干酵母或葡萄酒酵母[5]，具有明顯針對性，在其他果酒的生產中效果并不顯著[6]，獼猴桃果酒的特有風味不突出，因此亟待選育出適于獼猴桃果酒發酵的專用酵母。常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變以安全高效、操作簡便，并且正突變率較高、突變株遺傳穩定性好等諸多優勢在菌種選育等領域得到廣泛應用[7-9]。

本研究以從多年野生獼猴桃樹下土壤中分離得到了一株生香酵母X-5作為出發菌株，對其進行反復多次ARTP誘變，篩選發酵性能優良且遺傳穩定的酵母菌株，并通過控制酵母接種量、發酵溫度和初始pH值進行獼猴桃果酒的工藝條件優化，以期為生產優質獼猴桃果酒提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

徐香獼猴桃選自內鄉縣獼猴桃合作社；白砂糖、檸檬酸、酒石酸鉀：市售；偏重亞硫酸鉀、果膠酶：法國萊蒙特集團；出發菌株為實驗室篩選的葡萄園有孢漢遜酵母X-5[10]。

1.2 儀器與設備

紫外分光光度計（TU-1810）：北京普析通用儀器有限責任公司；手持糖度計（PAL-1）：日本ATAGO（愛拓）中國分公司；單人雙面凈化臺（SW-CJ-1F）：江蘇蘇中凈化設備有限公司；立式實驗室高壓壓力滅菌器（LDZM-40KCS）：上海申安醫療器械廠；pH計（PHSJ-3F）：上海雷磁儀器有限公司；ARTP-2誘變育種儀：北京艾德豪克國際技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養基配制

酵母浸出粉胨葡萄糖培養基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）、獼猴桃果汁培養基、沃勒斯坦實驗室（wallerstein laboratory，WL）瓊脂培養基、斜面培養基依據文獻[11]配制。

1.3.2 ARTP誘變

將菌種接種到YPD液體培養基中，28℃培養13h，菌液用無菌水洗滌2次～3次，稀釋至OD600nm為0.6～0.8，取菌液分別誘變 0、30、60、90、120 s，用無菌水適當稀釋后涂布于YPD平板，28℃培養24 h后菌落計數，參考文獻[12]所述方法，依據下式計算出每個處理的致死率，繪制致死率曲線。根據菌種致死率確定最適誘變時間。

根據致死率曲線，挑取致死率80%以上的誘變時間的單菌落平板劃線培養（28℃）；挑選WL培養基上生長良好的菌株，菌株經斜面培養活化后接入YPD液體培養基中，28℃培養24h后，將菌液接入裝有獼猴桃汁的三角瓶中，接種量為8%，28℃培養發酵8d，每天稱重一次，測定菌株發酵力、酒液的殘糖含量、VC含量、酒精度和香味等。以野生型酵母（X-5）為對照，綜合評定篩選出發酵性能、產香能力等較好的獼猴桃釀酒酵母。

1.3.3 遺傳穩定性試驗

將復篩得到的突變株Y-5在初篩斜面培養基中28℃連續傳代8次，液態發酵測定傳代后菌株CO2失重量、酒液的殘糖、VC含量、酒精度和香氣強弱。

1.3.4 獼猴桃果酒發酵工藝優化

1.3.4.1 單因素試驗

參考相關文獻[13]，固定初始糖度為240 g/kg，分別考察不同菌株Y-5接種量（6%、8%、10%、12%、14%）、不同初始 pH 值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0）、不同發酵溫度（10、20、25、30、35℃）條件下，發酵時間 7 d后所制備獼猴桃果酒的VC含量和酒精度。

1.3.4.2 正交試驗

正交試驗因素及水平見表1。發酵結束后測定各發酵瓶中發酵液酒精度、VC含量作為正交試驗指標。

表1 正交試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.5 分析檢測方法

以天平稱量CO2失重量來測定菌株發酵力，通過CO2失重法比較各菌株的發酵能力[14]。

采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》的規定方法測定糖含量（以還原糖計）、VC含量；采用GB 5009.225—2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定》規定方法檢測酒精度；采用嗅聞法判斷產香情況[15]。

1.4 數據處理

試驗數據采用平均值±標準差表示，使用SPSS21.0軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 ARTP誘變

2.1.1 ARTP誘變時間

按1.3.2方法對X-5菌株進行ARTP法誘變，結果見圖1。

圖1 菌株X-5誘變致死曲線Fig.1 Mutagenic lethal curve of strain X-5

由圖1可知，誘變處理60 s時，菌株X-5致死率為86.13%，能產生足夠突變，且有一定數量的存活菌體，從而實現ARTP法高效誘變，故確定ARTP誘變時間為60 s。

2.1.2 酵母菌的篩選

選擇6株生長較好的誘變后菌株和野生型酵母X-5做發酵力測試，結果如圖2所示。

圖2 不同菌株發酵時CO2失重變化曲線Fig.2 Variation curve of weight loss of CO2during fermentation by different strains

由圖2可見，6株誘變后菌株均于第2天達到最高的發酵速率，第4天后Y-5菌株發酵速率高于其他菌株水平；野生型菌株X-5發酵速率明顯低于其他菌株發酵速率，Y-5菌株在第2天發酵速率稍低，但在后期的發酵過程中其發酵速率較高，優于大多數的菌株。8 d后測定菌種發酵力（CO2總失重量）、發酵液殘糖含量、酒精度、VC含量及香氣強弱，結果如表2所示。

表2 不同菌株的發酵指標Table 2 Fermentation indexes of different strains

由表2可知，6株突變菌株CO2總失重量、殘糖和酒精度等指標均優于野生型菌株X-5，其中突變菌株Y-5綜合評定最佳，產香力強，性能優于野生型，發酵力比野生型X-5高50.98%，可用于后繼試驗。

2.1.3 遺傳穩定性分析

將復篩得到的突變株在初篩斜面培養基中于28℃連續傳代8次，發酵獼猴桃汁測定傳代后菌株發酵性能及產香能力如表3所示。

表3 菌株Y-5的發酵指標Table 3 Fermentation indexes of strain Y-5

菌株經過8次傳代并進行液態發酵，其發酵性能和產香能力差別不大，結果表明突變株Y-5具有較好的遺傳穩定性，發酵性能好，產香能力強，可以用于獼猴桃果酒發酵。

2.2 發酵工藝優化

2.2.1 單因素試驗

酵母接種量對獼猴桃果酒的VC含量及酒精度的影響如圖3所示。

圖3 酵母接種量對獼猴桃果酒VC含量及酒精度的影響Fig.3 Effect of yeast inoculation amount on VClevel and alcohol content of kiwifruit wine

從圖3可以看出，隨著酵母接種量的增加，獼猴桃果酒VC含量呈現先上升后下降的趨勢，這和周元等[13]研究結果一致，當酵母接種量大于8%時，果酒VC含量和酒精度逐漸下降，原因可能在于隨著酒精度的升高抑制了酵母的繁殖和活性[16]，另外過高的酵母濃度加速了酵母衰老死亡，為此，本研究選定8%為最佳酵母接種量。

發酵溫度對獼猴桃果酒VC含量及酒精度的影響見圖4所示。

圖4 發酵溫度對獼猴桃果酒VC含量和酒精度的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on VClevel and alcohol content of kiwifruit wine

從圖4可以看出，隨著發酵溫度的上升，果酒發酵速度加快，酒精度快速增加，但是較高的溫度會導致VC的損失，酒精度升高也會抑制酵母繁殖[16]，因此，當發酵溫度高于25℃后，VC含量和酒精度逐漸下降。另外，過低、過高的溫度均不利于果酒香氣及口感[17]。為此綜合考慮選定最佳發酵溫度為25℃。

發酵初始pH值對獼猴桃果酒VC含量及酒精度的影響如圖5所示。

圖5 發酵初始pH值對獼猴桃果酒VC含量和酒精度的影響Fig.5 Effect of initial pH on VClevel and alcohol content of kiwifruit wine

從圖5可以看出，VC含量及酒精度隨著pH值變大呈現先緩慢上升后下降的趨勢，當pH值為3.5時，VC含量和酒精度最高。宋淑紅[18]研究發現較低的初調pH值更有利于蘋果酒到達發酵終點，何晨等[19]認為過低或過高pH值會影響發酵速率，劉沁源等[20]研究發現初始pH值過低或過高均會影響果酒的風味與品質，為此本研究選定最佳初始pH值為3.5。

2.2.2 正交試驗

根據單因素試驗結果，以菌株Y-5接種量、發酵溫度、初始pH值為影響因素，以酒精度和VC含量為評價指標，采用L9（34）正交試驗設計對獼猴桃果酒發酵工藝條件進行優化。正交試驗的結果及分析分別見表4和表5，指標為酒精度和VC含量的正交試驗設計結果方差分析分別見表6和表7。

表4 正交試驗設計方案Table 4 The design scheme of orthogonal experimental

表5 正交試驗設計結果分析Table 5 Analysis of the results of orthogonal experimental design

表6 指標為酒精度的正交試驗設計結果方差分析Table 6 Analysis of variance of results of orthogonal experimental design with alcohol content as index

表7 指標為VC含量的正交試驗設計結果方差分析Table 7 Analysis of variance of results of orthogonal experimental design with VCcontent as index

采用綜合平衡法確定獼猴桃果酒工藝條件最優方案。從表5極差分析可以看出，空列極差在兩個指標分析里均為最小，說明可以不考慮因素間的交互作用；以酒精度為指標，因素主次順序為A（菌株Y-5接種量）＞B（發酵溫度）＞C（初始pH值），最優方案為A2B2C2；以VC含量為指標，因素主次順序為B（發酵溫度）＞C（初始pH值）＞A（酵母接種量），最優方案為B1C2A2；從表6和表7方差分析來看，初始pH值對VC含量影響不顯著，從表5可見，以VC含量為指標，B因素1水平和2水平差別不大，另外B因素選擇1水平（20℃）更有力于節約經濟成本和能源消耗。因此，綜合上述分析，確定正交試驗的最優組合為A2B1C2，即最佳獼猴桃果酒生產工藝條件是菌株Y-5接種量8%，發酵溫度20℃，初始pH值為3.5。采用該工藝條件發酵后的獼猴桃果酒呈微黃帶綠色，果香、酒香濃郁優雅，酒精度為11.23%vol，VC含量為0.411 g/L，綜合評價優于正交試驗表中方案，因此確定獼猴桃百香果果酒工藝條件為A2B1C2。

3 結論

試驗采用自然發酵法，將野生型菌株X-5誘變后，篩選出誘變菌株Y-5，性能優于野生型，發酵力、酒精度和VC含量分別比野生型高50.98%、11.15%和17.68%。以Y-5為發酵菌株，以VC含量和酒精度為指標，采用正交試驗優化其發酵條件，并經過方差分析，得到最佳工藝條件為菌株Y-5接種量8%，發酵溫度20℃，發酵初始pH值為3.5。試驗誘變后的菌株Y-5發酵力高于野生型酵母，發酵后果酒的典型性強，具有一定的經濟前景和推廣價值。