不同飼料對斷奶兔十二指腸、空腸結(jié)構(gòu)和消化酶活性影響

仲華玲，何叢叢，吳邦元

（1.江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學院淮安生物工程分院，江蘇 淮安 223000；2.西華師范大學生命科學學院，四川 南充 637000）

我國養(yǎng)兔歷史悠久，兔肉有“四高四低”特點（四高即高蛋白、高賴氨酸、高卵磷脂、高消化率，四低即低脂肪、低膽固醇、低尿酸、低熱量），肉兔還具有高產(chǎn)仔率、高幼崽成活率及高肉兔出欄率的特點，被廣泛飼養(yǎng)[1-2]。兔肉、兔毛、兔皮、兔糞、兔尿都可被有效利用[3-4]，兔文化遺產(chǎn)和精彩的神話傳說也給人們帶來寶貴的精神財富[5]。從飼養(yǎng)角度看，兔子以食用草料為主，飼養(yǎng)成本低，回報率高，因其食草，所以其腸道中微生物種類豐富[6-8]。在小腸中，十二指腸和空腸是營養(yǎng)物質(zhì)主要消化和吸收的場所，小腸的絨毛長度、寬度、表面積、隱窩深度的變化均會影響腸道營養(yǎng)吸收能力[9-10]，而絨毛長度與隱窩深度的比值（V/C值）則可以反映出小腸的功能狀態(tài)[11]。

動物生存和繁衍所需的營養(yǎng)物質(zhì)都依賴于食物，食物成分可影響動物的腸道結(jié)構(gòu)[12-13]，如粗纖維（CF）能改變家兔腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)[8,14]。但是，不同飲食方式對于執(zhí)行消化吸收功能的主要器官——十二指腸和空腸的結(jié)構(gòu)是否有影響值得進一步探索。因此，本研究以不同飼料條件下新西蘭兔為研究對象，利用組織學技術(shù)對其十二指腸和空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)進行分析，探討兩腸段在消化吸收功能上的差異，力求拓展飲食為新西蘭兔腸道結(jié)構(gòu)影響的研究提供參考，同時為兔子養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試驗動物及試驗材料

試驗選用24只30 d斷奶的、生長狀況良好的新西蘭兔，隨機分為A、B兩組。試驗飼養(yǎng)期間，兩組家兔在相同生長環(huán)境下喂養(yǎng)，均放置于試驗用的籠子中。其中，試驗A組僅以全價顆粒飼料飼喂，試驗B組僅以苜蓿鮮草為單一日糧飼喂。同時提供充足飲水，連續(xù)飼養(yǎng)60 d，試驗結(jié)束前一天饑餓處理1 d，于第2天剖殺取材。

1.2 日糧組成

A組采用由山東省臨沂市盛泉油脂化工有限公司江泉飼料廠生產(chǎn)的聚鑫明牌母幼兔通用配合飼料。該飼料適用于任何日齡新西蘭兔，飼喂按照我國家兔建議營養(yǎng)供給中顆粒飼料標準，全期每只每天平均相對飼喂量為100 g（范圍60～110 g，隨幼兔日齡增加而增大）這一標準。B組僅以苜蓿鮮草[15]為單一日糧飼喂，配成等能等氮的日糧。在試驗中使兩組幼兔平均每只每天所攝取的營養(yǎng)含量大致相當，且符合飼養(yǎng)標準，滿足4～9周齡生長兔營養(yǎng)需求，兩組日糧組成及營養(yǎng)水平結(jié)果見表1。

表1 試驗日糧配方及營養(yǎng)水平

1.3 主要儀器和試劑

光學顯微鏡（型號為CX50），日本OLYMPUS公司產(chǎn)品；電熱恒溫水浴鍋（型號為HHSY11-Ni），北京市長風儀器儀表公司產(chǎn)品；恒溫干燥箱（型號為DHG-9124），上海昕儀儀器儀表有限公司產(chǎn)品；組織切片機（型號為RM2236），德國Leica公司產(chǎn)品；蓋玻片、載玻片、鑷子、燒杯等，實驗室自備。

蘇木素（H3136）、伊紅Y（E4009），德國默克Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；二甲苯、100%乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、中性樹膠、1%鹽酸-乙醇等，實驗室自備。

2 方法

2.1 試驗取材及腸段長度和重量的測量

試驗結(jié)束后，分別將24只新西蘭兔處死并剖殺，其中12只立即取十二指腸和空腸組織樣品，先用生理鹽水清洗腸道，后放置于4%多聚甲醛中固定。

另外12只剖殺后取出十二指腸、空腸和盲腸，分別測量各腸段長度。收集各腸段內(nèi)容物后放入10 mL離心管中，-20℃冰箱保存?zhèn)溆茫糜谙负屠w維素酶活性的測定。清除消化道中內(nèi)容物后，稱量各段消化道重量。

消化道相對長度=消化道長度（cm）/體長（cm）；消化道相對重量（g/kg）=消化道重（g）/活重（kg）。

2.2 十二指腸和空腸組織切片的制作與染色

固定好的組織經(jīng)清水清洗后，分別放入75%、85%、95%和100%乙醇中脫水，然后放入二甲苯中透明后進行浸蠟和包埋處理，最后進行切片。

（1）切片與展片：切片厚度為5 μm，切出含有完整組織的蠟片，放入37℃恒溫水浴箱中使蠟片充分延展；

（2）貼片與烤片：取干凈做完標記并涂抹蛋白膠的載玻片，撈取組織，烘干進行染色；

（3）蘇木精和伊紅染色（Hematoxylin & eosin，H.E.）：將切好的切片經(jīng)過二甲苯和乙醇脫蠟后進行染色：蘇木素染液染色→水洗3～4次→顯微鏡觀察→1%鹽酸乙醇溶液→氨水→水洗2～3次→顯微鏡觀察→伊紅染液→水洗至澄清→顯微鏡觀察，然后進行脫水和再次透明，最后封固、干燥、觀察。

2.3 消化酶活性和纖維素酶活性的測定

消化酶活性的測定：剖殺后取出十二指腸及空腸中食糜，采用南京建成生物工程研究有限公司所生產(chǎn)的胰蛋白酶測定試劑盒（A080-2-1），按照操作說明測定十二指腸和空腸胰蛋白酶活性。

盲腸纖維素酶活力測定：羧甲基纖維素酶、水楊苷酶和木聚糖酶的酶活力的測定采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）比色法、DNS還原糖分析法測定[16]，酶活單位（IU）的定義為每分鐘每毫升酶液作用于底物生成的還原糖量（μmol）。

2.4 小腸相關(guān)指標測量

使用Olympus CX50光學顯微鏡分別在選取的切片上隨機截取3～5張結(jié)構(gòu)完整的腸道，測量絨毛高度、絨毛寬度、隱窩深度和肌層厚度等數(shù)據(jù)，同時計算絨毛高度與隱窩深度的比值以及絨毛表面積。具體測量方法見圖1。

圖1 小腸相關(guān)指標的測量方法

2.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均使用Excel 2019軟件整理，以“平均數(shù)±標準差（Mean±SD）”表示，使用IBM SPSS Statistics 24軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）比較兩組別之間的差異性，檢驗水準為α=0.05，若P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著，作圖用Excel 2019軟件。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同飼料對斷奶兔消化道相對長度及相對重量的影響

食草兔和食飼料兔十二指腸和空腸的相對長度和相對重均有顯著差異。空腸的相對長度和相對重量，食草兔極顯著高于食飼料兔（P＜0.01）；而十二指腸的相對長度和相對重量，食草兔顯著高于食飼料兔（P＜0.05），見表2。

表2 不同飼料對斷奶兔十二指腸、空腸的相對長度和相對重量的影響

3.2 不同飼料對斷奶兔十二指腸絨毛高度、隱窩深度和肌層厚度的影響

十二指腸的絨毛高度食草兔顯著高于食飼料兔（P＜0.05），而隱窩深度則是食飼料兔極顯著高于食草兔（P＜0.01）；兩者肌層厚度無顯著差異（P＞0.05），見圖2和圖3。

圖2 食草兔（左）和食飼料兔（右）十二指腸形態(tài)學變化情況

圖3 食草兔和食飼料兔十二指腸絨毛高度、隱窩深度及肌層厚度變化情況

3.3 不同飼料對斷奶兔空腸絨毛高度和隱窩深度的影響

食草兔空腸的絨毛高度和隱窩深度均顯著低于食飼料兔（P＜0.05），而肌層厚度兩者無顯著差異（P＞0.05），見圖4和圖5。

圖4 食草兔（左）和食飼料兔（右）空腸形態(tài)學變化情況

圖5 食草兔和食飼料兔空腸絨毛高度、隱窩深度及肌層厚度變化情況

3.4 不同飼料對斷奶兔十二指腸和空腸絨毛高度和隱窩深度比值的影響

十二指腸和空腸絨毛高度和隱窩深度比值均是食草兔極顯著高于食飼料兔（P＜0.01），見圖6。

圖6 食草兔和食飼料兔十二指腸和空腸絨毛高度和隱窩深度比值

3.5 不同飼料對斷奶兔十二指腸和空腸絨毛表面積的影響

食草兔十二指腸的絨毛表面積極顯著大于食飼料兔（P＜0.01），而食草兔空腸的絨毛表面積高于食飼料兔，但差異不顯著（P＞0.05），見圖7。

圖7 食草兔和食飼料兔十二指腸和空腸絨毛表面積

3.6 不同飼料對斷奶兔消化酶活性的影響

飼糧不同，對兔十二指腸和空腸胰蛋白酶活性有顯著影響，食草兔的十二指腸和空腸胰蛋白酶活性極顯著高于食飼料兔（P＜0.01），見圖8。

圖8 食草兔和食飼料兔十二指腸和空腸消化酶活性變化情況

3.7 不同飼料對斷奶兔盲腸纖維素酶活性的影響

食草兔和食飼料兔盲腸羧甲基纖維素酶、水楊苷酶和木聚糖酶酶活有顯著差異，食草兔上述3個纖維素酶活性極顯著或顯著高于食飼料兔（P＜0.05或P＜0.01），見圖9。可知食草兔盲腸對纖維的消化能力明顯高于食飼料兔。

圖9 食草兔和食飼料兔的盲腸纖維素酶活性

4 討論

4.1 不同飼料對斷奶兔十二指腸和空腸長度和重量的影響

十二指腸與空腸是消化道的重要組成部分，是機體營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要場所。本次試驗中，食草兔和食飼料兔十二指腸和空腸的相對長度和相對重量有顯著差異，食草兔顯著或極顯著高于食飼料兔（P＜0.05或P＜0.01），產(chǎn)生此差異的原因可能與兩種飼料中的纖維含量有關(guān)，苜蓿鮮草的纖維含量明顯高于全價配合顆粒飼料。本試驗結(jié)果與R.Jha等[17]、孫立俠[18]的研究結(jié)果類似，他們研究也發(fā)現(xiàn)纖維水平增高可使腸道長度和重量加大，因為高纖維能量密度低，導(dǎo)致兔采食量增大，促進消化道黏膜增生。

4.2 不同飼料對斷奶兔十二指腸和空腸結(jié)構(gòu)的影響

營養(yǎng)物質(zhì)的吸收大部分在小腸中完成，十二指腸、空腸表面布有腸絨毛、隱窩等結(jié)構(gòu)，腸絨毛的寬度和高度與隱窩的深度及絨毛高度與隱窩深度的比值（V/C值）可綜合反映腸道消化吸收能力的強弱[19-20]。絨毛高度越高，隱窩越淺，腸道的消化吸收能力越強。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)食草兔十二指腸的絨毛高度與絨毛表面積顯著高于食飼料兔，空腸的絨毛表面積也高于食飼料兔。有研究發(fā)現(xiàn)，隨著日糧纖維水平的提高，可以增加吉林白鵝腸道絨毛高度，提高消化吸收效率，促進腸道發(fā)育[18]，這與本試驗研究結(jié)果相似。但也有研究發(fā)現(xiàn)，日糧中性洗滌纖維水平對3～5月齡獺兔十二指腸、空腸的絨毛高度與隱窩深度均無顯著影響，但其含量增高，將促進腸道蠕動，提高消化吸收功能[21]。隱窩是小腸的上皮下陷至固有層而形成的指套狀結(jié)構(gòu)[15]，隱窩深度表示腸腺到黏膜表面的距離，它反映出腸道內(nèi)細胞產(chǎn)率，隱窩深度變淺表明基部細胞生成率降低，上皮細胞成熟率升高，營養(yǎng)物質(zhì)吸收能力增強。有研究發(fā)現(xiàn)十二指腸隱窩深度隨纖維水平的升高出現(xiàn)逐漸變小的趨勢，高纖維水平刺激上皮細胞成熟，使腸道對營養(yǎng)物質(zhì)吸收能力增強[12,22]。本試驗結(jié)果也發(fā)現(xiàn)食飼料兔十二指腸隱窩深度極顯著高于食草兔，食飼料兔空腸的隱窩深度極顯著高于食草兔，與上述研究結(jié)果一致。結(jié)果表明無論在十二指腸或是在空腸中，食苜蓿鮮草兔組小腸上皮細胞發(fā)育均較為完善，也表明十二指腸和空腸對苜蓿鮮草中營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力更強。

4.3 不同飼料對斷奶兔的消化酶和纖維素酶活性的影響

消化酶活性是反映動物生產(chǎn)性能及消化率高低的重要指標之一，消化酶負責催化體內(nèi)糖、脂肪和蛋白質(zhì)水解，對動物體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用極為重要。消化酶活性的提高，可促進機體消化系統(tǒng)對營養(yǎng)成分的消化吸收，提高消化效率，促進動物生長；其活性降低，則效果相反。兔的纖維消化主要依賴于盲腸中微生物分泌的纖維素酶，主要包含羧甲基纖維素酶、水楊苷酶和木聚糖酶等，其水平綜合反映盲腸微生物分解和消化纖維素與半纖維素的能力[23-24]。在本試驗中，食草兔的十二指腸和空腸胰蛋白酶與纖維素酶活性均顯著高于食飼料兔，推測纖維素的增加可提高腸道中胰蛋白酶與纖維素酶活性。研究發(fā)現(xiàn)飼糧中添加適量的苜蓿草粉可以提高仔豬胰蛋白酶的生物學活性[25]。與之類似的研究也發(fā)現(xiàn)飼料中纖維含量的增加，可增加兔盲腸內(nèi)的纖維素酶活性，增強盲腸對纖維素的消化吸收[26]。本次試驗結(jié)果與上述人員研究結(jié)果類似，食草兔盲腸羧甲基纖維素酶、水楊苷酶和木聚糖酶活顯著高于食飼料兔，這可能是因為家兔本身不能分泌纖維素酶，但家兔盲腸中存在大量的微生物，它們可不斷產(chǎn)生纖維素分解酶，降解草中的纖維，這三種消化酶活性的升高可促進腸道內(nèi)有益菌群的增殖，進一步促進食草兔對草食纖維的消化利用。纖維素酶的活性增加，推測與盲腸中的分泌纖維素酶的微生物有關(guān)，纖維可以被盲腸微生物分解成脂肪酸，脂肪酸可作為微生物的能量來源，增加盲腸內(nèi)與纖維分解相關(guān)微生物的數(shù)量，導(dǎo)致纖維素酶活性相對提高[27]。

5 結(jié)論

食草兔的十二指腸和空腸消化吸收能力和相關(guān)酶活性顯著高于食飼料兔，形成這種差異的原因可能是由于苜蓿草和顆粒飼料成分的差異，為適應(yīng)功能的需求而使結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生適應(yīng)性變化。