超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中硝基咪唑類藥物及其代謝物

徐媛原，張 微，張 楊，李凱華，朱 穎，肖 曼，吳 丹，張 兵*

（1.深圳市質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，深圳 518055；2.廣東省市場(chǎng)監(jiān)督管理局食用農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳 518055）

硝基咪唑類藥物作為抗生素和抗原蟲藥物，具有抗厭氧菌、廣譜、殺菌作用強(qiáng)、價(jià)格低和療效好等優(yōu)點(diǎn)[1]，因此常被用于預(yù)防和治療畜禽以及水產(chǎn)動(dòng)物的滴蟲病、球蟲病[2]。在畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，常見的硝基咪唑類藥物主要為甲硝唑、地美硝唑和洛硝噠唑等，原藥在生物體內(nèi)代謝為羥基化合物，主要為羥基甲硝唑（甲硝唑代謝產(chǎn)物）和羥甲基甲硝咪唑（地美硝唑和洛硝噠唑代謝產(chǎn)物）。硝基咪唑及其代謝物具有潛在的致癌性和致突變等毒性作用，長期濫用藥物后產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性[3]，易造成動(dòng)物源性食品殘留風(fēng)險(xiǎn)，因此歐美等發(fā)達(dá)國家已禁止在食源性動(dòng)物中使用硝基咪唑類藥物[4]。我國GB 31650—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》明確規(guī)定，甲硝唑和地美硝唑允許用于治療，不得在動(dòng)物性食品中檢出，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號(hào)規(guī)定洛硝噠唑在食品動(dòng)物中禁止使用，不得檢出。

目前，硝基咪唑類藥物及其代謝物主要檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫法[5]、高效液相色譜法[6-7]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8-9]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10-15]等。我國也制定了一些相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，如GB/T 21318—2007《動(dòng)物源食品中硝基咪唑殘留量檢驗(yàn)方法》，這類檢測(cè)方法前處理步驟繁雜，需多次提取、旋蒸、過柱等，消耗時(shí)間較多，且回收率偏低，不適宜大批量樣品檢測(cè)。本研究建立了簡(jiǎn)便、快捷和高效的水產(chǎn)品中硝基咪唑類藥物及其代謝物的檢測(cè)方法，可大幅縮短檢測(cè)周期，節(jié)省人力物力成本，提高檢測(cè)效率，適用于大批量的實(shí)際樣品檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 試劑與標(biāo)準(zhǔn)品

乙腈、甲醇和甲酸（色譜純），美國默克股份公司產(chǎn)品；超純水，Milli-Q超純水儀制得；固相萃取柱，Watses PRIME HLB 6 cc，200 mg。

分析標(biāo)準(zhǔn)品：甲硝唑、地美硝唑、洛硝達(dá)唑、羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑，純度均大于99%，購于德國Dr.Ehrenstorfre公司。

1.2 試樣準(zhǔn)備

水產(chǎn)品的試樣準(zhǔn)備按照GB/T 30891—2014規(guī)定執(zhí)行，魚類取可食部分（肌肉和魚皮）絞碎混合均勻后備用，蝦類取可食部分（蝦肉）絞碎混合均勻后備用，貝類將樣品清洗后開殼剝離，收集全部的軟組織和體液勻漿后備用，于-18℃冷凍避光保存。實(shí)際樣品源自深圳市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、商超和電商等。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取10.0 mg按純度折算100%質(zhì)量的甲硝唑、地美硝唑、洛硝達(dá)唑、羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇溶解并定容至10.0 mL，配制濃度為1 000 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃冰箱避光保存。分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.00 mL用甲醇定容至10.0 mL，配制濃度為100 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，逐級(jí)稀釋成10.0 μg·mL-1、1.00 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，4℃冰箱避光保存。

1.4 儀器設(shè)備

Agilent 1290Ⅱ超高效液相色譜串聯(lián)AB SCIEX三重四級(jí)桿5500質(zhì)譜儀配備電噴霧離子源，美國Agilent科技有限公司和美國SCIEX公司產(chǎn)品；梅特勒PL602E電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品；奧盛MTV-100自動(dòng)試管振蕩器，杭州奧盛儀器有限公司產(chǎn)品；Sigma 3-30KS高速離心機(jī)，德國Sigma公司產(chǎn)品；N-EVAP-24型全自動(dòng)氮吹儀，美國Organomation公司產(chǎn)品；Supelco visiprep SPE 24-port model固相萃取裝置，德國默克公司產(chǎn)品。

1.5 檢測(cè)方法

準(zhǔn)確稱取2.50 g（精確到0.01 g）均質(zhì)試樣于50 mL具蓋離心管內(nèi)，準(zhǔn)確加入10 mL 80%乙腈水提取液（含0.2%甲酸），2 500 r·min-1渦旋振蕩5 min，9 000 r·min-1離心5 min。吸取3.5 mL上清液直接過Watses PRIME HLB固相萃取柱，調(diào)整過柱速度，以1滴·s-1速度過柱，收集濾液于離心管中。準(zhǔn)確吸取濾液2.5～5.0 mL帶刻度離心管內(nèi)，在40℃水浴下氮?dú)獯抵翞V液少于0.5 mL，用10%甲醇水溶液（含0.1%甲酸）將殘留液定容至1.00 mL，2 000 r·min-1渦旋振蕩溶解殘留物1 min，溶解后的殘留物通過0.22 μm濾膜，液相色譜-質(zhì)譜上機(jī)測(cè)定。

1.6 儀器條件

1.6.1 液相色譜條件

色譜柱：BEH C18（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：A為1%甲酸水溶液，B為甲醇；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：5.00 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.6.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子模式；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）；電噴霧電壓：5.5 kV；離子源溫度：550℃；氣簾氣壓力：35 psi；碰撞氣壓力：9 psi；噴霧氣壓力：55 psi；輔助加熱氣壓力：55 psi。以定性定量離子的豐度比和保留時(shí)間定性，以峰面積定量。硝基咪唑類及其代謝物的質(zhì)譜參數(shù)見表2。硝基咪唑類及其代謝物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖見圖1。

表2 硝基咪唑類及其代謝物質(zhì)譜參數(shù)

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取不含待測(cè)物的空白魚肉樣品，分別添加硝基咪唑類及其代謝物（甲硝唑、地美硝唑、洛硝達(dá)唑、羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，制得濃度為1.00、2.00、5.00、10.0和20.0 μg·kg-1的系列加標(biāo)樣品，上述樣品按照1.5中的方法進(jìn)行前處理，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，以硝基咪唑類及其代謝物各化合物色譜峰面積為縱坐標(biāo)，各化合物的添加濃度為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 加標(biāo)回收率測(cè)定

分別向羅非魚、基圍蝦和花甲不含待測(cè)物的空白試樣中添加25 μL、75 μL濃度為100 μg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，25 μL濃度為1.00 μg·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行1.00、3.00和10.0 μg·kg-13個(gè)濃度水平的陽性添加回收率測(cè)定，每個(gè)濃度水平平行測(cè)定6個(gè)樣品，所有試樣均按照1.5中的方法處理，分別計(jì)算甲硝唑、地美硝唑、洛硝達(dá)唑、羥基甲硝唑、羥甲基甲硝咪唑的檢出限、精密度和回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以硝基咪唑類及其代謝物各化合物的特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，添加濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表3，可知在1.00～20.0 μg·kg-1線性范圍內(nèi)，甲硝唑、地美硝唑、洛硝達(dá)唑、羥基甲硝唑、羥甲基甲硝咪唑的相關(guān)系數(shù)分別為r=0.999 3、r=0.999 7、r=0.999 4、r=0.999 4和r=0.999 5，各化合物特征離子質(zhì)量色譜峰面積與相應(yīng)加標(biāo)回收濃度的線性關(guān)系良好。

表3 硝基咪唑類及其代謝物線性特征參數(shù)及檢出限

2.2 方法檢出限

以空白魚肉為基質(zhì)，以最低添加濃度進(jìn)行檢驗(yàn)，根據(jù)GB/T 27417—2017《合格評(píng)定化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》確定檢出限的方法，采用信噪比法評(píng)估檢出限，根據(jù)3倍信噪比確定該方法各項(xiàng)目的檢出限見表3，甲硝唑、地美硝唑、洛硝達(dá)唑、羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑的檢出限分別為0.211、0.191、0.123、0.137和0.266 μg·kg-1，表明該方法靈敏度較高。

2.3 回收率和精密度

本研究以空白羅非魚、基圍蝦和花甲為基質(zhì)，按照1.5中的前處理方法分別對(duì)甲硝唑、地美硝唑、洛硝達(dá)唑、羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑進(jìn)行1.00、3.00和10.0 μg·kg-13個(gè)濃度水平的回收率測(cè)定，每個(gè)濃度水平平行測(cè)定6個(gè)樣品，計(jì)算出各物質(zhì)不同濃度水平的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表4。

表4 加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

由表4可知，該方法的回收率、精密度良好，在3個(gè)不同加標(biāo)濃度水平下，甲硝唑、地美硝唑、洛硝達(dá)唑、羥基甲硝唑、羥甲基甲硝咪唑的回收率范圍分別為85.9%～106.0%、85.7%～106.1%、87.1%～105.6%、87.4%～105.4%、96.3%～106.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍分別為3.2%～7.0%、3.9%～6.7%、3.7%～5.3%、3.6%～6.6%和3.4%～8.9%，各基質(zhì)各項(xiàng)目均符合GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》的要求以及國標(biāo)方法對(duì)該類物質(zhì)的檢測(cè)分析要求。表明該方法精密度、靈敏度更高，檢出限低，適用于水產(chǎn)品中硝基咪唑類藥物及其代謝物的測(cè)定。

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

將本研究建立的方法應(yīng)用于檢測(cè)水產(chǎn)品中硝基咪唑類藥物及其代謝物殘留量。實(shí)際樣品采樣于深圳市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、商超和電商等。采集品種主要包括草魚、福壽魚、鱸魚、基圍蝦和花甲等鮮活水產(chǎn)品，采集數(shù)量共計(jì)10份。檢測(cè)結(jié)果顯示，在實(shí)際樣品中未檢測(cè)出硝基咪唑類藥物及其代謝物。

3 結(jié)論

本研究方法建立了水產(chǎn)品中硝基咪唑類藥物及其代謝物殘留量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。該方法采用少量試劑提取，Watses PRIME HLB固相萃取柱凈化，與傳統(tǒng)的方法相比，無需消耗大量有機(jī)試劑，采用通過式固相萃取方式，無需進(jìn)行活化、淋洗、洗脫等繁瑣步驟，極大地減少了試劑消耗，縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。本方法通過多種水產(chǎn)品基質(zhì)驗(yàn)證，結(jié)果表明前處理過程簡(jiǎn)便和快捷，不僅極大縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)效率，且該方法檢出限更低、精密度更高、定性定量更準(zhǔn)確，適用于水產(chǎn)品中甲硝唑、地美硝唑、洛硝達(dá)唑、羥基甲硝唑和羥甲基甲硝咪唑的殘留量檢測(cè)。