IL-15過表達對豬骨骼肌細胞成肌分化的影響

邢明杰，顧憲紅，王梟鴻，郝月

中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所/動物營養學國家重點實驗室，北京 100193

0 引言

【研究意義】肉類是人類最重要的蛋白質來源之一，其含有脂肪、維生素和大量的礦物質元素，在維持人類的正常生長、發育和健康中發揮著重要作用。骨骼肌的質量約占機體體重的40%—50%，因此肌肉細胞的分化和增殖與豬的生長速度密切相關。我國是世界上最大的肉類消費國，生豬的產量占世界的一半，豬肉消費量更是占世界的46%。在過去的幾十年里，提高生豬生長速度和肌肉質量一直是養豬生產的主要關注點。而骨骼肌的生長和發育直接影響豬肉的產量和質量，因此了解骨骼肌的生長機制十分重要。【前人研究進展】骨骼肌不僅是最大的運動系統，還是一種內分泌器官，它在收縮過程中將數百種肌肉細胞因子分泌到血液中。其中一些可以通過內自分泌/旁分泌的方式在肌肉細胞中發揮局部作用，或以內分泌的方式對遠處的組織發揮作用。IL-15作為一種細胞因子，通過與IL-15受體特異性結合，在自身免疫和惡性腫瘤發生中發揮重要作用，因此IL-15的失調會對宿主造成不利影響。早期的研究發現，IL-15是刺激骨骼肌細胞生長的重要合成因子。在肌萎縮和炎性等條件下，IL-15可抑制骨骼肌蛋白質的水解，維持骨骼肌的質量。同時，IL-15通過 JAK3/STAT3信號轉導增加葡萄糖轉運蛋白 4（GLUT4）的轉錄和膜轉位，增強PPARδ、PGC-1α和PGC-1β的活性，有利于線粒體的生物合成和脂肪酸氧化，從而增強骨骼肌細胞對葡萄糖的攝取。小鼠、人類和牛骨骼肌培養物的研究表明，添加重組IL-15可以誘導肌管的肥大表型，增加收縮蛋白的積累，促進肌球蛋白重鏈（MHC）的累積和骨骼肌質量的增加。IL-15可以直接作用于已分化的肌管，促進肌細胞的增生和肥大，并調控骨骼肌蛋白沉積。IL-15參與肌肉與脂肪組織的代謝，QUINN提出IL-15軸信號可以改變動物的胴體組成，是肉類生產和研究的一個新機制。隨后印遇龍團隊和陳杰團隊分別在豬體外和體內的研究佐證了這一觀點，即IL-15抑制豬胴體脂肪沉積，改變胴體組成，可以作為研究畜牧業肉品質調控的一個靶點。【本研究切入點】目前關于IL-15對骨骼肌的作用研究主要集中在嚙齒動物（小鼠）和人類醫學上，且多是通過外源添加IL-15的方法來增加其在細胞中的表達，而關于IL-15的表達對豬骨骼肌成肌細胞作用的報道鮮見。【擬解決的關鍵問題】本研究利用豬骨骼肌衛星細胞體外誘導成肌分化模型，模擬豬骨骼肌生長發育過程，通過改變豬骨骼肌成肌細胞中 IL-15的表達水平，研究 IL-15的過表達對豬骨骼肌成肌細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗進行時間及地點 試驗于2019年 7—12月在中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所動物營養學國家重點實驗室完成。

1.1.2 細胞株 豬骨骼肌衛星細胞由中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所動物營養學國家重點實驗室分離凍存。

1.1.3 主要儀器 二氧化碳培養箱（SANYO）；熒光倒置顯微鏡（Nikon）；通用酶標儀（Biotek）；流式細胞儀（Miltenyi Biotec）；數顯式穩壓穩流電泳儀、轉膜儀（Bio-Rad）；凝膠成像系統（上海天能科技有限公司）；熒光定量PCR儀（Applied Biosystems）等。

1.1.4 主要試劑 骨骼肌細胞專用培養基購自賽百慷（上海）生物技術股份有限公司；DMEM低糖培養基，胎牛血清，山羊血清和 0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司；RIPA裂解液，電泳液，電轉液和 TBS購自北京索萊寶公司；ECL化學發光試劑盒購自晶彩公司；Protease inhibitor cocktail購自美國Sigma公司；BCA試劑盒購自北京康為公司；RNA快速提取試劑盒購自Qiagen公司；反轉錄試劑盒購自Takara寶生物公司；All-in-OneTM qPCR Mix，購自GeneCopoeia公司；IL-15 ELISA試劑盒購自Novus公司；CCK-8試劑盒（Cell counting Kit-8）購自日本同仁化學研究所；IL-15一抗，caspase-3一抗和α-SMA一抗均購自Abcam公司；GAPDH一抗，羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗購自北京中杉金橋公司；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；陰性對照病毒Ubi-MCS-3FLAG-CBh- gcGFP-IRES-puromycin購自上海吉凱基因化學技術有限公司；其他試劑為國產分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 豬骨骼肌衛星細胞的分離培養及誘導分化

1.2.1.1 分離培養 將一周齡仔豬動脈放血致死，用75%的酒精擦拭全身消毒，無菌條件下分離仔豬大腿骨骼肌，置于含有雙抗（青霉素-鏈霉素）的 PBS中反復漂洗3—5次，用眼科剪將組織剪成1 mm大小，加入0.25% Trypsin在37℃水浴條件下消化30 min，然后用完全培養基中和消化液。將所得的組織混合物過100 μm篩網后，收集濾液進行1 500 r/min離心10 min，棄上清，用培養基重懸細胞，轉入T-25培養瓶中，37℃、體積分數5% CO無菌細胞培養箱中，靜置培養，每隔24 h換液。

1.2.1.2 誘導分化 取第二代的豬骨骼肌衛星細胞接種于L-多聚賴氨酸鋪底的培養瓶中，待細胞融合度為50%—60%左右時，加入DMEM（低糖）+2%山羊血清的分化培養基，分化5 d。每2—3 d換液，期間不斷觀察細胞的生長狀況。

1.2.2 過表達 GV-492-IL-15慢病毒載體的構建按照吉凱基因提供的過表達慢病毒載體構建和包裝手冊 Verision4.0（https://www.genechem.com.cn/public/static/uploads/data_download/ 1576639299905887.pdf）的方法構建慢病毒過表達載體GV-492-IL-15（圖1）。該載體攜帶綠色熒光蛋白（GFP）及HI/I酶切位點。利用限制性內切酶獲得線性化載體，對酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳并回收目的條帶。設計引物（引物信息如表1所示），從吉凱基因公司的質粒文庫中釣取目的基因，目的基因進行PCR擴增，其中目的基因IL-15 GenBank登錄號為NM_214390。擴增后的目的基因產物交換入線性化表達載體，交換反應產物加入到感受態細胞菌液中進行轉化，質粒提取，并送至上海吉凱基因公司測序。將測序結果正確的質粒轉染293T細胞中，通過Western Blot進行質粒表達檢測，最后用實時定量 PCR（qRTPCR）法進行病毒滴度檢測。

圖1 GV492載體圖譜Fig. 1 GV492 vector profiles

表1 PCR引物信息Table 1 The primer information of PCR

1.2.3 IL-15過表達慢病毒轉染 收獲分化后的豬骨骼肌成肌細胞，消化后以1.0×10個細胞/孔接種于6孔培養板中，加入生長培養基培養，次日待細胞貼壁后，換液。加入1 mL完全培養基，再分別加入20 μL對照慢病毒與GV492-IL-15重組慢病毒（MOI=100），混勻后繼續培養，處理細胞 72 h，形成空白細胞（Control）、空載體對照（IL-15-）和轉染 GV492-IL-15重組慢病毒（IL-15+）3個試驗處理組。

1.2.4 實時定量 PCR（qRT-PCR）檢測細胞IL-15基因的表達 使用無EDTA的胰蛋白酶消化細胞，1 000 r/min離心5 min。收集細胞，檢測IL-15基因表達。采用TRNzol總RNA提取試劑進行樣本RNA提取，實驗操作均按照說明書進行。使用 NanoDrop?ND-2000測定RNA濃度和純度之后，進行變性瓊脂糖凝膠電泳。之后采用PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser進行逆轉錄合成 cDNA。使用Applied Biosystems StepOnePlus實時PCR系統進行qRT-PCR分析。使用Ct（2）方法計算相關RNA表達。qRT-PCR中使用的所有引物均在北京Invitrogen公司合成，其中序列信息如表2所示。

表2 qRT-PCR引物信息Table 2 The primer information of qRT-PCR

1.2.5 Western Blot檢測細胞內IL-15目的蛋白和active caspase-3蛋白的表達 蛋白質印跡方法根據文獻[27]的方法操作，將預冷的PBS洗滌細胞兩次，去除多余的培養基，然后用含有蛋白酶抑制劑（PMSF，終濃度為1 mol·L）的裂解液（RIPA）提取蛋白，冰上裂解20 min。將裂解液在4℃下以13 000 r/min離心20 min，收集上清液進行分析。用BCA法檢測上清液中的蛋白濃度。通過10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質（20 μg），并轉移至NC膜上，轉膜完成后以麗春紅染色試劑對膜進行染色，觀察效果并做好標記，再用含3%脫脂奶粉室溫輕搖孵育30 min。加入3%脫脂奶粉稀釋的一抗（IL-15，1∶2 000稀釋，active caspase-3，1∶500稀釋），4℃孵育過夜。隨后與二抗（山羊抗兔IgG（H+L）HRP，1∶10 000）室溫下輕搖孵育40 min，TBST洗膜6次，每次3 min。Western Blot條帶用ECL超敏化學發光試劑盒顯影。

1.2.6 酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測細胞培養液中IL-15水平 通過離心法收集培養物上清液的樣品，以 1 500 r/min離心 10 min以除去細胞碎片。根據Novus公司說明書檢測上清液中IL-15的含量。加入終止液30 min內，使用酶標儀測量450 nm的吸光度值，并設定540 nm或570 nm作為校正波長。復孔讀數取平均值，然后減去平均零標準品OD值。最后通過繪制標準品濃度做對數與相應 OD值對數生成曲線，通過回歸分析確定最佳擬合曲線，通過樣本的OD值，可以從標準曲線上得到樣本中IL-15濃度。

1.2.7 流式細胞儀檢測細胞周期 參考梁亞冰等的方法，使用無 EDTA的胰蛋白酶消化細胞，1 000 r/min離心5 min，收集細胞，PBS洗滌后，以75%的預冷乙醇固定過夜，1 000 r/min離心10 min棄乙醇，用含PI 100 μg·mL和RNAase 200μg·mL的染液溫育30 min，流式細胞儀檢測凋亡細胞峰，其熒光信號經流式細胞儀Multicycle細胞周期分析軟件處理。

1.2.8 流式細胞儀檢測細胞凋亡 采用 AnnexinⅤ-PI雙標染色法檢測細胞凋亡率。使用無EDTA的胰蛋白酶消化細胞，1 000 r/min離心 5 min。加入1×AnnexinV 結合液重懸細胞后加入 5 μL Annexin V-FITC、5μL PI混勻，室溫避光下培養15 min，隨即用流式細胞儀進行檢測。

1.2.9 CCK-8法檢測細胞增殖 使用 CCK-8試劑盒檢測細胞增殖。按照說明書進行實驗操作，細胞以每孔1×10個接種于96孔板中，每孔加入100 μL培養基，每孔設置4個重復。每孔添加10 μL CCK-8，然后將細胞在37℃下培養1 h。通過酶標儀分別于4、8、12和24 h讀取450 nm處OD值。

1.2.10 數據統計與分析 采用SPSS 26.0軟件統計分析。所有試驗均重復3次，數據以平均值±SE表示。組間比較使用單因素方差分析，以＜0.05表示差異顯著。文中圖形均采用 GraphPad Prism 8.0（美國GraphPad Software 公司）繪制。

2 結果

2.1 豬骨骼肌成肌細胞的分離培養和誘導成肌分化

取仔豬大腿骨骼肌肉組織進行無菌分離培養，24 h后進行換液，用顯微鏡觀察細胞形態（圖2-A、B），細胞貼壁生長，可見呈現出梭形或紡錘形態。隨后加入分化培養基進行成肌分化，最終呈現出誘導分化后的管狀細胞（圖2-C—E）。

圖2 豬骨骼肌衛星細胞及成肌分化Fig. 2 Skeletal muscle satellite cells and differentiated myoblasts

2.2 慢病毒載體的構建

將測序鑒定后正確的質粒轉染 293T細胞，一定時間后，細胞內可觀察到明顯的熒光（圖3-A），說明目的質粒轉染正常、目的質粒熒光標記基因表達正常。經Western Blot檢測，可以觀察到20 kD附近處有明顯特征條帶（圖3-B），其大小和目的基因融合蛋白相吻合。表明質粒過表達成功。

圖3 目的質粒轉染293T細胞結果Fig. 3 Results of 293T cells transfected with target plasmid

2.3 骨骼肌細胞鑒定

將分化成熟的成肌細胞，進行α-SMA單克隆抗體免疫熒光染色。視野中90%的細胞呈陽性反應，胞漿染成紅色，表明培養的細胞為骨骼肌細胞（圖4）。

圖4 豬骨骼肌成肌細胞α-SMA染色鑒定Fig. 4 Identification of porcine skeletal muscle myoblast cells by α-SMA staining

2.4 IL-15目的基因表達以及IL-15蛋白檢測

分別用Western Blot和qRT-PCR方法檢測骨骼肌細胞內IL-15的蛋白和mRNA表達。與其他組相比，轉染 IL-15病毒組顯示出更高的蛋白和 mRNA表達（＜0.05，圖5-A—C），證明細胞成功轉染IL-15過表達慢病毒。隨后又用 ELISA檢測細胞上清中IL-15的分泌情況（圖5-D）。結果發現，試驗組與對照組差異不顯著，即目標蛋白IL-15沒有被分泌到細胞外。

圖5 GV-492-IL-15慢病毒載體的過表達Fig. 5 Overexpression effects of GV-492-IL-15

2.5 IL-15過表達對成肌細胞增殖的影響

通過 CCK-8、流式細胞術等試驗進一步研究IL-15過表達對成肌細胞增殖的影響，結果如圖6所示。CCK-8試驗結果顯示，IL-15過表達組與對照組相比，細胞活力顯著升高（＜0.05）（圖6-A）。與空白細胞和空載體組細胞相比，轉染IL-15過表達慢病毒載體的細胞，G1期細胞比例顯著下降，S期和G2/M期細胞比例顯著升高（＜0.05，圖6-B）。以上結果表明，過表達IL-15可促進豬骨骼肌成肌細胞的增殖。

圖6 細胞增殖和細胞周期分布圖Fig. 6 Cell proliferation and cell cycle distribution diagram

2.6 細胞凋亡分析

采用流式細胞儀進行Annexin V-FITC/PI測定，檢測 IL-15的過表達對豬骨骼肌成肌細胞凋亡水平的影響。其中Q1區域為機械損傷細胞，Q2（FITC+/PI+）區域為晚期凋亡或壞死細胞，Q3（FITC+/PI-）區域為早期凋亡細胞，Q4（FITC-/PI-）區域為活細胞（圖7-A）。結果顯示，IL-15的過表達對細胞早期凋亡的影響差異不顯著，但可以抑制細胞的晚期凋亡。與對轉染空載體組相比，細胞凋亡由1.03%下降到 0.04%，且差異極顯著（＜0.001）（圖7-B）。

圖7 細胞凋亡分析Fig. 7 Apoptosis analysis

隨后又采用Western Blot技術檢測與細胞凋亡密切相關的caspase-3蛋白表達的變化。結果發現，與對照組相比，IL-15的過表達使caspase-3蛋白有下降的趨勢，但差異不顯著（＞0.05）（圖7-D）。

3 討論

骨骼肌不僅是肉類的重要組成部分，其正常的功能對畜禽的健康也起著重要作用。研究發現，骨骼肌還是一種分泌器官。PEDERSEN等將收縮活動或其他的刺激下而產生、表達和釋放的，并發揮自分泌、旁分泌或內分泌功能的細胞因子、趨化因子或其他肽（5—20 kD）歸類為“肌肉因子”。最近的研究已經確定了600多種的肌肉因子，然而人們對于這些大多數肌肉因子的生物活性功能還未充分定性，因此仍需要進行廣泛的研究才能深入了解其作用于肌肉的相關機制。目前研究比較多的肌肉因子有 IL-6、IL-8、IL-15、Irisin（鳶尾素）和成纖維細胞生長因子 21（FGF21）等。

3.1 IL-15過表達慢病毒載體的構建

在過去的研究中，研究人員采用直接向培養的細胞中添加超生理水平的 IL-15進行研究。由于IL-15的半衰期比較短（小于 40 min），因此需要不斷向培養物中添加 IL-15才能滿足試驗需求，這樣不僅工作量大，還造成試驗成本的提高。慢病毒載體則是將目的基因轉移并整合到哺乳動物細胞中的有效工具，它有能夠轉導分裂的和未分裂的細胞的優勢，因此在細胞和基因治療中廣泛應用。本試驗采用吉凱基因研發的GV492慢病毒載體，構建 IL-15過表達的慢病載體，轉染豬骨骼肌成肌細胞，利用基因工程體外研究 IL-15的過表達對豬骨骼肌成肌細胞的影響，也為以后的研究提供思路和原材料。

3.2 IL-15的作用機理

IL-15是一種廣泛表達的細胞因子，與大多數其他細胞因子不同的是，IL-15是以分泌形式和細胞內形式發揮作用的。在正常情況下主要定位在細胞內（包括細胞核），但是TNF-α的存在以時間依賴性地誘導 IL-15Rα和 IL-15向細胞核外輸出。TNF抑制染色體區域維持因子 1（chromosomal region maintenance 1，CRM1）對IL-15Rα和IL-15的核定位，并且在ADP-核糖基化因子6（ADP-ribosylation factor 6，ARF6）的參與下促進IL-15的胞吐作用。在本試驗中用ELISA檢測細胞上清液中IL-15的水平，發現與對照組相比，轉染 IL-15慢病毒組細胞上清液中 IL-15的含量并未發生顯著變化。這說明骨骼肌在正常（未受到不良刺激）生理條件下，IL-15的產生是定位在細胞內并發揮作用的。因此下一步的研究應關注當豬骨骼肌細胞遭受到如TNF-α或其他外界不利刺激時，IL-15是否會分泌到細胞膜外并發揮作用。

3.3 IL-15對骨骼肌細胞凋亡的影響

骨骼肌細胞的增殖和分化是胚胎發育過程中骨骼肌正常發育所需的關鍵過程，是產后骨骼肌再生所需的關鍵過程，也是損傷或運動后肌肉修復的必要條件。IL-15能降低多種類型細胞的凋亡，如上皮細胞，成纖維細胞，和神經元細胞等，是一種抗凋亡因子（脂肪組織除外）。關于 IL-15對骨骼肌凋亡的抑制機制，通過試驗給荷瘤小鼠施用IL-15，導致TNF-α受體含量顯著減少，提示IL-15可能通過影響TNF-α信號來減少肌肉萎縮過程相關的蛋白質損失和細胞凋亡，保存肌肉質量。然而PISTILLI等研究發現，通過向大鼠長期注射 IL-15可促進骨骼肌細胞凋亡，可能是IL-15 的抗凋亡特性對細胞類型或存在的肌肉病理程度具有特異性。在TIE等對草魚的研究中，將IL-15描述為一種促凋亡因子，然而在試驗草魚宰殺后，隨著肌肉細胞的凋亡并沒有伴隨有 IL-15轉錄水平的升高而增加，說明 IL-15在骨骼肌中可能不是促凋亡因子。本研究發現，IL-15的過表達對正常骨骼肌細胞早期凋亡沒有顯著的影響，但是對晚期凋亡有明顯的抑制作用，說明 IL-15可抑制骨骼肌細胞凋亡。隨后檢測了細胞中與凋亡相關的 caspase-3蛋白的含量變化。發現轉染 IL-15過表達慢病毒后，caspase-3蛋白的含量變化不大。這可能是由于IL-15對正常條件下的成肌細胞的作用有限，只有當細胞受到不良刺激下才會顯示出顯著的作用。

3.4 IL-15對骨骼肌細胞增殖的影響

IL-15最初是基于其支持自然殺傷（NK）T淋巴細胞增殖而被分離出來，通過激活PI3K/Akt、Ras/Raf和JNK/AP1等一系列信號通路可能有助于IL-15對細胞分化和增殖。研究發現，IL-15可通過JAK-STAT通路促進成纖維/成脂前體細胞（FAP）的增殖，其中顯著抑制FAP細胞的成脂分化，促進肌肉慢性損傷后的肌管再生。前人在肌肉細胞培養試驗中觀察到，添加IL-15可調節蛋白質的合成/降解速率，促進肌管的肥大和收縮蛋白的積累，被認為是一種合成代謝細胞因子，不會刺激成肌細胞的增殖或分化。而本研究的結果則顯示，在豬骨骼肌成肌細胞中過表達 IL-15基因，可顯著增加細胞活力。

細胞增殖和凋亡與細胞周期息息相關，已知細胞周期分為G0/G1、S和G2/M期，G0/G1期為細胞處于阻留的狀態，S期為DNA合成時期，G2/M為有絲分裂期。在本研究中，IL-15的過表達阻滯在G0/G1期的成肌細胞顯著低于對照組，而處于 S期和 G2/M期的成肌細胞則顯著高于對照組，說明處于分裂狀態的細胞顯著增加，在 IL-15的作用下，成肌細胞分裂速度加快，細胞周期的分布明顯改變。綜合CCK-8、細胞周期分布和細胞凋亡的結果，說明過表達 IL-15基因能夠顯著影響豬骨骼肌成肌細胞的功能。

4 結論

本研究分離豬骨骼肌衛星細胞，通過誘導分化為成肌細胞，并利用轉染構建的IL-15過表達慢病毒載體，成功獲得IL-15過表達的豬骨骼肌成肌細胞。研究發現，在正常生理條件下，IL-15是定位在細胞內并發揮作用的，其過量表達可以抑制豬骨骼肌成肌細胞的晚期凋亡，并促進細胞有絲分裂。研究明確了IL-15對豬骨骼肌細胞成肌分化的具體調控作用，為進一步開展 IL-15在豬細胞成肌分化中的調控機制研究奠定基礎。