酸性土壤硝化作用對柑橘銨毒害的效應

范子晗，羅雅尹，熊華燁，張育文，康福蓉，王昱桁，王潔，石孝均，張躍強

西南大學資源環境學院，重慶 400715

0 引言

【研究意義】作為全球最重要的經濟作物之一，2019年我國19個省份的柑橘栽培面積和產量分別達到262萬公頃和4 585萬噸，均居世界首位。我國柑橘主產區位于降雨豐沛的熱帶和亞熱帶地區，土壤酸化和養分不平衡，且pH低和缺氧條件下的土壤銨化率高于硝化率，土壤富含 NH。柑橘園中存在的氮肥不合理施用導致一系列的環境和生態問題，嚴重限制了我國柑橘產業的可持續發展。因此，研究柑橘對酸、堿性土壤中銨態氮水平的響應以及柑橘銨毒害產生機制，對指導柑橘生產中氮肥的合理施用具有重要意義。【前人研究進展】土壤中氮的礦化和硝化作用是氮循環中的重要過程。在酸性土壤中，土壤硝化速率被證明相對較低，且硝化速率隨著土壤pH的降低而降低。作為柑橘生長必需的營養元素，NH-N和NO-N是可被柑橘直接吸收利用的氮源。我國柑橘年均氮肥用量為494 kg·hm，其中無機氮施用量占總量的91.4%。三峽重慶庫區柑橘園生產體系中氮素主要來源于三元復合肥、尿素和碳銨，土壤酸化和傳統施肥方式導致果園生產體系氮養分高盈余量和高銨硝比，造成果園土壤環境氮素高負荷。大量施用含銨肥料導致我國主要農田酸化嚴重，抑制硝化速率，影響柑橘植株的生長以及氮素吸收。植物的銨毒害癥狀包括生物量降低、根系構型改變、根冠比下降、葉片失綠等。不同種屬或同一種屬不同品種之間也存在不同的銨耐受性，通過對前人關于植物不同氮素形態的喜好相關研究發現，可可樹、水稻、藍莓、茶樹喜銨態氮；而油菜、棉花、烤煙以及一些藻類對銨態氮敏感，易出現毒害現象。此外，越來越多的證據表明，銨中毒是由氧化還原穩態受損引起的，這增加了活性氧（ROS）的產生，細胞內的抗氧化酶（過氧化物酶POD、過氧化氫酶CAT、超氧化物歧化酶SOD、抗壞血酸過氧化物酶 APX）在此時被激發來降低活性氧的累積。植物吸收 NH后，主要的代謝途徑有谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶（GS/GOGAT）、谷氨酸脫氫酶（GDH）和天冬酰胺合成酶（AS）。銨轉化為氨基酸和酰胺的總速率低于通過氨基酸分解代謝、硝酸鹽還原、苯丙代謝和光呼吸吸收和細胞生產銨的速率時，會造成植物組織銨毒性積累。硝酸還原酶（NR）、天門冬酰胺酶（AS）、谷氨酰胺合成酶(GS)作為催化和調節氮代謝的關鍵酶，每一種酶都可以看作是植物氮素吸收和利用能力的指標。【本研究切入點】目前，我國關于柑橘不同形態氮素施用的系統研究較少，且主要集中在柑橘的氮素喜好、銨硝配比及吸收動力學方面，針對柑橘銨毒害系統研究鮮見報道，有待研究。【擬解決的關鍵問題】選擇我國具有代表性的砧木——香橙，以銨態氮為研究對象，通過盆栽試驗探究酸性土壤中柑橘銨毒害的產生原因、特征及響應機制，為柑橘氮素科學管理提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗地點與試驗材料

試驗開展于西南大學國家紫色土肥力與肥效監測基地。供試酸性土壤為黃壤，pH 4.13，有機質含量 4.98 g·kg，堿解氮 83.1 mg·kg，有效磷 4.20 mg·kg，速效鉀 73.0 mg·kg。供試石灰性土壤為紫色土，pH 8.50，有機質 21.2 g·kg，堿解氮 52.0 mg·kg，速效磷 13.3 mg·kg，速效鉀為 156 mg·kg。土壤速效磷測定時酸性土壤采用Bray法，堿性土壤采用 Olsen法。土壤經自然風干，去除雜質后磨細過篩備用。供試柑橘砧木幼苗為香橙（Tanaka）。

1.2 試驗設計

試驗為雙因素試驗設計，主處理為2種土壤，分別為黃壤和紫色土。副處理為5個銨態氮水平，分別為 0、50、100、200、400 mg·kg，分別用 A0、A50、A100、A200和A400表示。每個處理10次重復。

1.3 試驗方法

2019年10月種子經催芽萌發后移栽入苗圃，2020年1月待種子長到5葉齡時，移入盆中。盆高21 cm，直徑21 cm，每盆裝土6 kg，磷鉀肥作為基肥裝盆時與土混勻裝入。過磷酸鈣供磷，施磷量100 mg·kg，硫酸鉀供鉀，施鉀量150 mg·kg。一盆種植兩株柑橘砧木幼苗。利用分析純硫酸銨試劑在2020年11月以營養液形式按照處理要求一次施入，其余按照柑橘種植常規管理進行，土壤含水量保持為田間持水量的70%。處理前一周布置土壤溶液采集器（Rhizon 19.21.01 SMS），如圖1。

圖1 土壤溶液采集裝置示意圖Fig. 1 Schematic diagram of soil solution collection device

1.4 樣品采集與項目測定

1.4.1 樣品采集 通過土壤溶液采集器隔天采集土壤溶液，并將采集液置于-20℃冰箱保存。于試驗第15天和第30天各取5盆采集柑橘幼苗的地上部和地下部，把采集的柑橘根莖葉分開，用去離子水洗凈后晾干。取一部分根、莖、葉稱鮮重后，在105℃殺青2 h后在75℃烘干并記下干重，烘干后粉碎用于元素分析；另一部分根和葉用液氮速凍后保存在-80℃冰箱用于生理指標的測定。

1.4.2 土壤溶液 使用流動分析儀（AA3）測定土壤銨態氮和硝態氮的質量濃度；土壤溶液 pH用電位計法測定。

1.4.3 植株丙二醛含量 用10%三氯乙酸研磨至勻漿后離心，取上清液與0.5%硫代巴比妥酸反應后于450、532和 600 nm下比色。

1.4.4 植株氮含量的測定 用HSO-HO消煮，并用半微量凱氏定氮法測定氮含量。

1.4.5 抗氧化系統酶活性 氮同化酶活性以及植株銨態氮硝態氮含量采用試劑盒法，試劑盒由蘇州科銘生物技術有限公司提供。

1.4.6 參數計算 本文中涉及的相關指標計算公式如下：

1.5 統計分析

使用 SPSS統計軟件進行雙因素和單因素的方差分析（ANOVA）。均數分析采用最小差異檢驗（LSD）進行比較（＜0.05），使用Excel進行圖表的制作。

2 結果

2.1 土壤類型與銨態氮供應水平對土壤溶液銨態氮硝態氮濃度的影響

如圖2所示，兩種土壤的土壤溶液銨態氮濃度均隨硫酸銨施用量的增加而上升。與酸性土壤相比，石灰性土壤的銨態氮濃度下降較快。如圖3所示，兩種土壤的土壤溶液的銨硝比均呈先下降后穩定的趨勢，石灰性土壤溶液銨硝比在施用硫酸銨后15 d左右已經趨近于0，而酸性土壤土壤溶液在24 d依然保持4.52的銨硝比，并呈穩定趨勢。

圖2 銨態氮供應水平對土壤溶液銨態氮，硝態氮含量的影響Fig. 2 Effects of NH4+-N levels on concentrations of ammonium nitrogen and nitrate nitrogen in soil solution

圖3 銨態氮供應水平對土壤溶液銨硝比的影響Fig. 3 Effects of NH4+-N level on NH4+/NO3- of soil solution

如圖4所示，兩種土壤在施用硫酸銨后pH均下降，到了第24天時，與A0相比，A50、A100、A200、A400處理酸性土壤的pH分別降低了0.077，0.290，0.190和0.113個單位；石灰性土壤的pH降低了0.170，0.713 ，0.743 和0.777個單位。

圖4 銨態氮供應水平對土壤溶液pH的影響Fig. 4 Effect of NH4+-N level on pH of soil solution

2.2 兩種土壤中銨態氮供應水平對柑橘生長的影響

由表1可知，葉片和地上部的生物量呈先上升后下降趨勢，在A100處理時達到最大值，與A0處理相比分別上升了 20.2%和 16.6%。不同銨態氮施用量下的莖、根、總生物量及根冠比無顯著差異。如表2所示，銨態氮水平下酸性土壤中生長的幼苗根長顯著大于石灰性土壤，而根表面積、根體積和根平均直徑無顯著差異。酸性土壤上生長的柑橘幼苗根系的根長、根表面積和根體積隨施銨量上升呈先上升后下降趨勢。A50處理的根長最高，較A0處理上升了34.6%，而A400處理時最低，較A0處理降低了13.0%。不同銨態氮水平下柑橘的根表面積、根體積和根平均直徑無顯著差異。由圖5可見，兩種土壤柑橘根系活力與銨態氮水平呈顯著負相關性，酸性土壤=0.82，石灰性土壤=0.28。

表1 銨態氮供應水平對柑橘生物量的影響Table 1 Effects of NH4+-N levels on citrus biomass

表2 兩種土壤中銨態氮供應水平對柑橘幼苗根系形態的影響Table 2 Effects of NH4+-N levels on root morphology of citrus seedlings in two soils

圖5 兩種土壤中銨態氮供應水平對柑橘幼苗根系活力的影響Fig. 5 Effects of NH4+-N levels on root activity of citrus seedlings in two soils

2.3 兩種土壤中銨供應水平對柑橘抗氧化系統的影響

由表3可見，兩種土壤中生長的柑橘葉片的CAT和SOD活性有顯著差異，APX和POD無明顯差異。根系的CAT、SOD和POD活性有顯著差異，且酸性土壤中生長的柑橘根系CAT、SOD活性小于石灰性土壤，POD活性大于石灰性土壤。不同供應水平下，柑橘葉片的CAT和APX活性無明顯差異；而SOD和POD隨銨態氮施用量的提高呈先上升后下降趨勢，分別在A50和A100處理達到最大值，與A0處理相比分別提高了4.53%和469%。CAT、APX、SOD和POD在15和30 d取樣時的活性均有顯著差異，除POD以外，其他酶的活性均為30 d低于15 d。各施銨處理的根系CAT、APX、SOD和POD酶活性均大于A0處理。SOD和POD活性隨著施銨量的上升呈先上升后下降趨勢，分別在A100和A200處理達到最大值，分別比A0處理上升了44.7%和66.9%。CAT、APX、SOD和POD在15和30 d取樣時的活性均有顯著差異。CAT和SOD的活性30 d取樣的低于15 d取樣的，APX和POD的活性30 d取樣的大于15 d取樣的。

表3 銨態氮供應水平對不同土壤中柑橘抗氧化酶活性的影響Table 3 Effects of NH4+-N levels on antioxidant enzyme activities in citrus leaves grown in different soils

2.4 兩種土壤中銨態氮供應水平對柑橘氮代謝的影響

如表4所示，兩種土壤中生長的柑橘葉片和根系的各氮代謝酶活性均有顯著差異。酸性土壤中生長的柑橘葉片 GS、NR和GDH活性低于石灰性土壤，而AS和GOGAT活性高于石灰性土壤；而酸性土壤中生長的柑橘根系GS、GOGAT、AS和NR活性高于石灰性土壤，而GDH活性低于石灰性土壤。隨著銨態氮水平的上升，葉片GS、GOGAT、GDH的活性均在 A100處理時達到最大值，先上升后下降趨勢，但是葉片NR的活性隨著銨態氮上升而下降。根系的GS和GOGAT活性隨著銨態氮的升高呈先上升后下降趨勢，分別在A200和A100處理達到最大值；GDH和NR活性隨銨態氮的升高而降低，AS活性隨銨態氮水平的升高而升高。從取樣時間來看，不同取樣時間對酶活性有顯著影響，根系除 GDH活性15 d取樣的低于30 d的外，GS、AS、NR和GOGAT活性均為15 d取樣的高于30 d。葉片除NR的活性15 d取樣的小于30 d以外，30 d取樣的GS、GOGAT、GDH活性均為15 d取樣的高于30d。

表4 銨態氮供應水平對不同土壤中柑橘葉片氮代謝酶活性的影響Table 4 Effects of ammonium levels on nitrogen metabolism enzyme activities in citrus leaves on different soil

如表5所示，酸性土壤中葉片和根系硝態氮顯著低于石灰性土壤，而銨態氮沒有顯著差異。根系葉片的銨態氮含量隨銨態氮水平的提高呈先上升后下降趨勢，而硝態氮含量無顯著差異。如表6所示，酸性土壤中生長的柑橘葉氮含量均低于石灰性土壤，而莖和根無顯著差異；除酸性土壤上生長的柑橘莖、葉和總的氮累積量均低于石灰性土壤，根系沒有顯著差異。隨著施銨量的升高，柑橘莖、葉和根的氮含量呈先上升后下降趨勢，且在 A200處理時達到最大值。柑橘的莖、葉、根和總的累積量隨銨態氮水平呈先上升后下降趨勢，根、莖和葉在A200處理達到最大值，總累積量在A100處理時達到最大值。

表5 銨態氮供應水平對不同土壤中柑橘葉片和根中無機氮含量的影響Table 5 Effects of NH4+-N levels on inorganic nitrogen content in citrus leaves in different soils

表6 銨態氮供應水平對不同土壤中柑橘葉片氮含量和累積量的影響Table 6 Effects of NH4+-N levels on nitrogen concentration and accumulation in citrus leaves in different soils

通過柑橘各部位的生物量、氮累積量、氮濃度、葉綠素含量和根系形態指標進行聚類分析（圖6）。柑橘形態指標的聚類結果顯示，當平均距離為10時，可以將酸性土壤中的銨態氮水平處理分成兩類。當堿性土壤中的銨態氮水平平均距離為20時，不施氮處理和施氮處理各分成兩類。

圖6 銨態氮供應水平對香橙生長相關指標聚類分析Fig. 6 Cluster analysis of NH4+-N level on growth related indexes of Xiangcheng seedling

3 討論

3.1 酸性土壤和石灰性土壤銨態氮的轉化過程

土壤硝化作用對土壤pH高度敏感，土壤最大硝化速率與土壤 pH呈顯著正相關。研究顯示，pH每降低一個單位，土壤的硝化速率就會減少42%。在本研究中，酸性土壤的土壤溶液中銨態氮更高，銨硝比保持較高狀態（圖2，圖3），這與鮑俊丹等在培養試驗中的結果一致。一般認為土壤 pH與硝化作用的這種關系可能是由于低pH抑制硝化微生物的生長，故不利于硝化作用的進行，而在堿性土壤條件下氨氧化菌豐度較大，適宜硝化作用的進行。同時，施用硫酸銨后酸性土壤和石灰性土壤的pH均有下降，與前人對茶園土壤的研究一致。

3.2 兩種土壤銨態氮供應水平對柑橘生長發育的影響

氮素具有促進柑橘生長，增加生物量的作用，有研究認為樹種對氮素形態的偏好與土壤pH相關，推測柑橘具有喜銨性。但在對產區大多分布在酸性土壤的柑橘研究中發現，與硝態氮相比，銨態氮對柑橘的根、莖、葉以及總生物量均產生了顯著抑制，表現出明顯的喜硝性。在本試驗中，30 d的試驗對柑橘生物量無顯著差異（表1），這說明短期高銨對柑橘生物量影響不大。但高銨對柑橘根系伸長和根系活力產生了抑制作用（表2，圖2），這可能是由于根系作為生長于土壤中吸收、運輸 NH的主要器官，是高NH脅迫下最直接的響應和被毒害器官，與前人的研究結果表現一致。高銨增加了MDA含量，并激發了根系的氧化應激反應（表3），說明高銨加劇了膜脂過氧化程度。且植物的抗氧化系統酶可以有效地清除活性氧，保護其免受破壞性的氧化反應，與前人的研究結果一致。由于 NH特性和酶活性的復雜性，導致酶活性的變化規律不一致：高銨增加了葉片POD酶活性，而其他抗氧化酶活性變化不大（表3），推測POD是此時起主要作用的抗氧化酶。

3.3 柑橘氮代謝對兩種土壤銨態氮供應水平的響應

植物對氮素的吸收和累積表現了同化和利用氮的能力。本研究中，酸性土壤柑橘根系中GS、GDH、AS和NR的活性較高。酸性土壤柑橘葉片中GOGAT和GDH活性較高，GS和AS的活性較低。并且高銨降低了根系GOGAT和GDH的活性而增加了AS和GS的活性，高銨增加了葉片AS的活性，降低了NR的活性（表4），與前人的研究結果一致。這是由于在植物體內經一系列的生化過程，NH離子不斷產生，這些離子在植物細胞中的積累導致組織損傷，造成銨毒性癥狀的出現，與前人的研究結果一致。這些因素共同作用促進植物的氮代謝，是植物的基本生理過程。本研究酸性土壤中，柑橘植株的銨態氮含量顯著大于石灰性土壤（表5），且柑橘幼苗的根莖葉的總氮累積量較低（表6），這可能由于石灰性土壤經過硝化作用產生的大量硝態氮會對毒害作用進行緩解。

綜上所述，土壤中的氮素轉化與土壤的pH密切相關，酸性土壤上施銨量超過100 mg·kg時柑橘幼苗的生長受到抑制，而在石灰性土壤上過量使用銨態氮并未顯著抑制柑橘生物量，意味著銨毒害的強度與土壤的硝化作用強度密切相關。

4 結論

與石灰性土壤相比，酸性土壤銨態氮施用過量導致土壤溶液中銨離子長時間累積，對柑橘造成毒害。銨毒害現象首先發生在根系，表現為抑制柑橘根系伸長且降低根系活力，同時造成葉片和根系MDA含量增加，細胞膜受損和氮代謝失調等銨毒害現象，說明柑橘銨毒害與土壤硝化作用密切相關,酸性土壤中尤為值得關注。