膠體金免疫層析法測定山楂制品中羅丹明B

李 倩，楊國偉，張 燁

（山西省檢驗檢測中心藥品檢驗技術研究所，山西太原 030001）

羅丹明B，也叫花粉紅，是一種人工合成的脂溶性熒光染料，呈鮮桃紅色。通過食物鏈進入人體后，經過生物轉化會產生致癌作用，我國已明確規定禁止其在食品中使用。但由于羅丹明B具有價格低廉、顏色鮮艷、著色穩等特點，某些小作坊為了降低成本仍違法將其添加到食品中。為保障食品安全，需要建立快速、穩定、成本可控的檢測方法。羅丹明B最常見的實驗室檢測方法有高效液相色譜法[1-2]、液相色譜儀質譜/質譜法[3]等，其中色譜法檢測食品中羅丹明B具有準確、靈敏度高的優點。但是樣品前處理復雜，還需要用到凝膠色譜凈化系統、液相、質譜等大型檢測設備，準入門檻較高，難以在基層檢測部門中開展，目前只能在少部分實驗室中使用，也無法實現現場檢測。

膠體金免疫層析法具有操作簡單、耗時短、特異性強、無需昂貴檢測儀器等優點，尤其適合高通量初篩。目前我國市場上已有數家利用此技術的商品化試劑盒，適合在快檢中推廣使用。因此，本研究選擇膠體金免疫層析技術[4-8]作為本方法的主要檢測手段。本實驗通過優化前處理方法，建立以膠體金免疫層析技術為基礎的檢測方法，該方法的建立為食品中羅丹明B的現場質量控制提供了依據，同時也為食品樣品的大批量初篩提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

移液槍；中佳高速離心機；多管漩渦混合儀；電子天平；固相萃取小柱（中性氧化鋁柱，1 000 mg/6 mL）；深圳易瑞免疫膠體金試劑盒；正己烷、丙酮、甲醇、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉均為分析純。

山楂片（空白樣品），山楂條（空白樣品），均購自太原本地大型超市，經檢測不含羅丹明B。

1.2 試驗方法

1.2.1 對照品溶液的制備

稱取羅丹明B，加甲醇定容、混勻制得0.1 μg·mL-1的標準溶液。臨用新配。

1.2.2 復溶液的配制

①pH=6.8磷酸鹽緩沖液。取0.2 mol·L-1磷酸氫二鈉溶液25 mL，加0.2 mol·L-1氫氧化鈉溶液11.8 mL，再加水至100 mL，混勻即得。②pH=7.1磷酸鹽緩沖液。取0.2 mol·L-1磷酸氫二鈉溶液67 mL，加0.2 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液 33 mL，混勻即得。③pH=7.4磷酸鹽緩沖液。磷酸氫二鈉1.36 g，加0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液79 mL，加水至200 mL，混勻即得。

1.2.3 前處理方法

取山楂制品2 g于50 mL具塞離心管中，加15 mL丙酮-正己烷（8∶2），振蕩提取3 min，以8 000 r·min-1離心2 min。上清液待凈化。將全部的上清液轉移至中性氧化鋁小柱中，并用15 mL丙酮-正己烷（8∶2）淋洗中性氧化鋁小柱，流出液全部棄去。再加入甲醇5 mL洗脫并收集洗脫液，氮氣吹干。精密加入500 μL復溶液，渦旋混合1 min，作為待測液。

2 結果與分析

2.1 實驗條件的選擇

2.1.1 提取試劑的選擇

考察水、磷酸鹽緩沖液、乙醇、甲醇和丙酮-正己烷（8∶2）溶液對羅丹明B的提取效果。結果表明，水溶液的提取系統中水、磷酸鹽緩沖液含水量高會影響中性氧化鋁小柱的活性，不適用于固相萃取小柱，不利于濃縮和富集。有機相的提取系統中乙醇、甲醇和丙酮屬于親水性有機溶劑，提取樣品雜質較多。而丙酮-正己烷（8∶2）溶液具有一定的親水性又有一定比例的親脂性對羅丹明B的提取效果較好，且適用于固相萃取。故選擇丙酮-正己烷（8∶2）作為提取劑。

2.1.2 洗脫液體積的選擇

羅丹明B經固相萃取系統濃縮富集后，需加入甲醇進行洗脫，分別考察1 mL、3 mL、5 mL和10 mL體積的洗脫效率，發現淋洗體積超過5 mL樣品的結果趨于穩定。考慮到時效性選擇5 mL作為洗脫體積取值。

2.1.3 高效液相色譜法測定固相萃取小柱耐用性

選擇市場上不同品牌的中性氧化鋁固相萃取小柱（規格：1 g/6 mL），進行耐用性評價，回收率均在60%～120%，說明固相萃取小柱的耐用性良好，見表1。

表1 耐用性實驗結果

2.1.4 復溶液的選擇

對比pH=6.8磷酸鹽緩沖液、pH=7.1磷酸鹽緩沖液、pH=7.4磷酸鹽緩沖液這3種溶液的點板效果。結果顯示pH=7.1磷酸鹽緩沖液復溶效果比較好，可以得到滿意的點板效果。

2.1.5 測定時間

本研究考察了復溶后0 min、5 min、10 min、20 min、30 min和60 min測定效果。結果表明，隨著時間的延長，待測液點板后T線顏色逐漸變深，不利于結果的真實判定，因此本方法建議復溶后立即測定。

2.1.6 孵育溫度

為了考察溫度對抗原抗體反應的影響，本研究對比了18 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃下的反應效果。在上述各溫度下，30～40 ℃孵育下T線檢測結果較明顯。因此為了避免極端監測環境對于檢測相關各個環節的影響，建議日常檢驗在室內或相對溫和的檢驗環境中進行，故本方法中孵育溫度建議為30～40 ℃。

2.2 結果判定以及測定步驟

2.2.1 結果判定

由圖1知，陽性結果：檢測線未能顯色或顏色較控制線顏色淺，表明樣品中羅丹明B檢出為陽性。陰性結果：檢測線顏色比控制線顏色深或者二者顏色一致，表明樣品中羅丹明B未檢出為陰性。

圖1 免疫膠體金試紙條檢測情況

2.2.2 結果性能指標計算

取已購空白樣品200份，分別加入0 μg·kg-1、2.5 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1和 10.0 μg·kg-1的羅丹明 B，按照步驟進行測定。由表2可知，5 μg·kg-1以上濃度均可以滿足要求，可以作為本方法的檢出限。

2.3 交叉反應

分別取蘇丹紅Ⅰ-Ⅳ、誘惑紅、胭脂紅、羅丹明6G和羅丹明123標準物質，制成水平為20 ng·mL-1的標準溶液，按照本方法進行實驗，考察試劑盒與上述化合物的交叉反應。結果表明上述化合物均無交叉反應。

2.4 高液相色譜法測定不同基質的加標測定結果的一致性分析

使用高液相色譜法對20份分別添加0倍、1倍、2倍檢出限水平的空白及陽性樣品進行檢定。由表3知，測試結果表明回收率均滿足檢測要求（回收率要求在60%～120%），即0 μg·kg-1均未檢出為陰性，5 μg·kg-1、10 μg·kg-1均可以檢出為陽性，均與本方法表2中的結果保持一致。

表2 考察本方法性能指標計算表

表3 不同基質加標回收率測定結果

3 結論與討論

本文通過優選提取試劑和復溶溶液，優化了洗脫溶液的洗脫體積，并對常見中性氧化鋁小柱進行耐用性評價，同時還考察測定時間、孵育溫度對實驗的影響，使得單樣時間得以控制在1 h之內。實際測定結果表明該方法較傳統實驗室常用的液相色譜法、液相色譜質譜聯用技術、酶聯免疫方法操作更加簡便快速，回收率符合要求，假陽性率較低，特異性強，成本低，時間較實驗室方法大大縮減，非常適合實驗室大批量快速篩查以及有一定實驗操作基礎的基層工作人員現場檢測。但要注意到商品化快檢試劑盒為本方法應用過程中的關鍵環節。建議應用試劑盒前對其性能指標進行考察評價，符合方法學性能指標和評價準則各項要求后方可使用。此外，方法使用過程涉及樣品前處理和結果判讀等關鍵步驟，如果操作不當將直接影響測定結果。建議對方法使用者進行必要的培訓。同時本方法為篩選方法，篩查出的陽性結果應用參比方法對結果進行進一步的確證。