茯磚茶中冠突散囊菌的檢測(cè)條件研究

劉 靜，舒 靜，秦 婧

（陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西西安 710048）

茯磚茶隸屬中國(guó)茶葉六大分類(lèi)中的黑茶，目前盛產(chǎn)于陜西省涇陽(yáng)縣和湖南省安化縣，其中涇陽(yáng)是茯磚茶的發(fā)源地，于1368年前后形成定型的涇陽(yáng)茯磚茶，如今更是陜西涇陽(yáng)縣的地理標(biāo)志產(chǎn)品[1]。

茯磚茶在發(fā)花過(guò)程中，通過(guò)控制一定的溫濕度，促進(jìn)優(yōu)勢(shì)菌種的生長(zhǎng)，產(chǎn)生大量的金黃色的閉囊殼，俗稱(chēng)“金花”，“金花”的多少是鑒別茯磚茶品質(zhì)好壞的標(biāo)準(zhǔn)[2]。研究表明，“金花”在茯磚茶中繁殖時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的酶類(lèi)，這些酶使原料中的纖維素、果膠質(zhì)、淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪和多酚等物質(zhì)分解，對(duì)改善茯磚茶的品質(zhì)有著積極的作用[3]。多數(shù)學(xué)者都對(duì)茯磚茶發(fā)花中的優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行鑒定，認(rèn)為冠突散囊菌是優(yōu)勢(shì)菌[4-7]。2012年，丁婷等[8]也研究證明了陜西涇陽(yáng)茯磚茶中優(yōu)勢(shì)菌為冠突散囊菌。

檢測(cè)茯磚茶中的冠突散囊菌不僅可以評(píng)價(jià)茶葉質(zhì)量，更能促進(jìn)茯磚茶的良好發(fā)展，因此對(duì)冠突散囊菌進(jìn)行檢測(cè)至關(guān)重要。現(xiàn)行的茯磚茶標(biāo)準(zhǔn)中提及冠突散囊菌的主要有《緊壓茶 第3部分：茯磚茶》（GB/T 9833.3—2013）[9]和《緊壓茶 第3部分：茯磚茶》（DBS 61/0006—2014）[10]，其中所指定的檢測(cè)方法均為《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》（GB 4789.15—2016）[11]，這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中霉菌和酵母的計(jì)數(shù)方法，其中第一法適用于各類(lèi)食品中霉菌和酵母的計(jì)數(shù)，第二法適用于番茄醬罐頭、番茄汁中霉菌的計(jì)數(shù)；對(duì)于冠突散囊菌的檢測(cè)并未作出詳細(xì)規(guī)定。本文針對(duì)GB 4789.15—2016中的第一法-平板計(jì)數(shù)法對(duì)冠突散囊菌的檢測(cè)細(xì)節(jié)條件進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

15份茯磚茶，購(gòu)自陜西各超市賣(mài)場(chǎng)；孟加拉紅瓊脂，購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；霉菌培養(yǎng)箱；生物安全柜；拍擊式均質(zhì)器；渦旋混勻儀。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)方案

為了能夠做到均衡取樣，取樣方法選擇中心五點(diǎn)法和對(duì)角線(xiàn)五點(diǎn)法進(jìn)行比較研究，其中中心五點(diǎn)法是在對(duì)茯磚茶的兩條對(duì)角線(xiàn)作四等分，分割點(diǎn)即為取樣點(diǎn)，對(duì)角線(xiàn)五點(diǎn)法則是對(duì)茯磚茶的其中一條對(duì)角線(xiàn)進(jìn)行六等分，同樣，分割點(diǎn)即為取樣點(diǎn)；中心五點(diǎn)法[12]示例見(jiàn)圖1，對(duì)角線(xiàn)五點(diǎn)法示例見(jiàn)圖2。除了要考慮均衡取樣，所有樣本的均質(zhì)時(shí)間也應(yīng)當(dāng)保持一致，均質(zhì)時(shí)間選擇15 s、30 s、60 s進(jìn)行比較研究，從而選擇出既能節(jié)省試驗(yàn)時(shí)間又能充分均質(zhì)樣品的均質(zhì)時(shí)間。

圖1 中心五點(diǎn)法示例

圖2 對(duì)角線(xiàn)五點(diǎn)法示例

1.2.2 試驗(yàn)方法

本次研究對(duì)共計(jì)15份茯磚茶樣本按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》（GB4789.15—2016）第一法 霉菌和酵母平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行檢驗(yàn)。秤取25 g樣品，加入225 mL無(wú)菌生理鹽水，用拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)拍打，制成1∶10的樣品勻液。取1 mL 1∶10的樣品勻液注入一支含有9 mL的無(wú)菌生理鹽水的試管中，用渦旋混勻儀混均后制成1∶100的樣品勻液，若有需要，可重復(fù)上述步驟繼續(xù)稀釋。選擇2～3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，在進(jìn)行10倍梯度稀釋的同時(shí)，每個(gè)稀釋度分別吸取1 mL樣品勻液分別加入2個(gè)無(wú)菌平皿中，同時(shí)分別吸取1 mL無(wú)菌生理鹽水加入兩個(gè)無(wú)菌平皿作為空白對(duì)照，及時(shí)將20～25 mL冷卻至46 ℃左右的孟加拉紅瓊脂傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻，置于水平臺(tái)面待培養(yǎng)基完全凝固后置于培養(yǎng)箱內(nèi)（28±1）℃培養(yǎng)，觀察并記錄至第5天的結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 取樣方法比較

對(duì)每一份樣本都稱(chēng)取兩份試驗(yàn)樣本，一份按照中心五點(diǎn)法取樣，一份按照對(duì)角線(xiàn)五點(diǎn)法進(jìn)行取樣，每個(gè)取樣點(diǎn)取樣約5 g，總計(jì)25 g，進(jìn)行標(biāo)注后加入無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)袠颖揪|(zhì)60 s后按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)》（GB 4789.15—2016）第一法 霉菌和酵母平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行檢驗(yàn)，菌落計(jì)數(shù)時(shí)，用肉眼觀察計(jì)數(shù)，冠突散囊菌在孟加拉紅瓊脂平板上生長(zhǎng)形態(tài)為圓形、邊緣白色至鵝黃色、中心呈黃褐色、絨毛狀，也有未生長(zhǎng)大的菌落為小的白色絨毛狀菌落。選擇計(jì)數(shù)結(jié)果在10～150 CFU的稀釋度，用平均數(shù)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可。最終統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同取樣方法的結(jié)果統(tǒng)計(jì)

由表1知，中心五點(diǎn)法取樣所測(cè)得的數(shù)據(jù)均比對(duì)角線(xiàn)五點(diǎn)法取樣所測(cè)得的數(shù)據(jù)大，原因可能是中心五點(diǎn)法的取樣點(diǎn)位置均為茯磚茶的較為中間的部位，其冠突散囊菌分布相對(duì)均勻，而對(duì)角線(xiàn)五點(diǎn)法取樣位置中有兩個(gè)取樣點(diǎn)比較靠近茯磚茶邊緣的部位，而邊緣部分的冠突散囊菌一般分布較少，相較而言，中心五點(diǎn)法更能代表樣品的真實(shí)情況。

2.2 均質(zhì)時(shí)間比較

對(duì)中心五點(diǎn)法的試驗(yàn)樣本先均質(zhì)15 s后按照標(biāo)準(zhǔn)要求，取出1 mL直接進(jìn)行梯度稀釋并選適宜的稀釋度進(jìn)行試驗(yàn)，剩余的樣本繼續(xù)均質(zhì)15 s后再次按照標(biāo)準(zhǔn)要求，取出1 mL直接進(jìn)行梯度稀釋并選適宜的稀釋度進(jìn)行試驗(yàn)，最后剩余樣本繼續(xù)均質(zhì)30 s后同樣按照標(biāo)準(zhǔn)要求，取出1 mL直接進(jìn)行梯度稀釋并選適宜的稀釋度進(jìn)行試驗(yàn)，最終得到的3份試驗(yàn)樣本，即均質(zhì)時(shí)間分別為15 s、30 s、60 s的試驗(yàn)樣本。對(duì)所有試驗(yàn)樣本按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)后，觀察計(jì)數(shù)后計(jì)算結(jié)果。結(jié)果統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 不同均質(zhì)時(shí)間的結(jié)果統(tǒng)計(jì)

由表2知，隨著拍擊時(shí)間的延長(zhǎng)，所測(cè)得的冠突散囊菌數(shù)據(jù)也越來(lái)越大。均質(zhì)15～30 s時(shí)，數(shù)據(jù)增幅較大，而30～60 s的數(shù)據(jù)增幅較為平緩，原因可能是15s拍擊時(shí)間過(guò)短，很多茶葉樣本還沒(méi)有得到充分的均質(zhì)，冠突散囊菌沒(méi)有釋放至樣品勻液中，30 s時(shí)大多數(shù)茶葉樣本得到充分均質(zhì)，從而釋放更多的冠突散囊菌至樣品均液中，60 s時(shí)拍擊時(shí)間長(zhǎng)，茶葉樣本得到充分的均質(zhì)，冠突散囊菌的釋放也逐步達(dá)到頂點(diǎn)；拍擊時(shí)間大于1 min時(shí)數(shù)據(jù)或許仍會(huì)有所增加，但考慮到總試驗(yàn)時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)、霉菌孢子容易擴(kuò)散等因素，拍擊時(shí)間不宜超過(guò)1 min。

3 結(jié)論

本次研究立足陜西特色產(chǎn)品的檢驗(yàn)，結(jié)合實(shí)際工作經(jīng)驗(yàn)，依據(jù)現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)對(duì)陜西涇陽(yáng)茯磚茶中冠突散囊菌的檢測(cè)條件進(jìn)行研究分析，分析結(jié)果顯示中心五點(diǎn)取樣法較對(duì)角線(xiàn)五點(diǎn)取樣法測(cè)得的數(shù)據(jù)更大，更能代表樣本的真實(shí)情況，且隨著拍擊時(shí)間的增長(zhǎng)，所測(cè)得的數(shù)據(jù)也會(huì)增加，但最終會(huì)趨于穩(wěn)定，但考慮到總實(shí)驗(yàn)時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，孢子容易擴(kuò)散等因素，均質(zhì)時(shí)間不宜超過(guò)1 min。此次研究雖然樣本量采集遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，且很多其他條件尚未摸索，但能為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件的選擇及研究提供一定的支撐。