飲料中腐敗酵母菌的分離、鑒定及控制研究

周 婀，馬 瑜

（1.上海康識(shí)食品科技有限公司，上海 201101；2.陜西省微生物研究所，陜西西安 710043）

酵母菌（Yeasts）是一類單細(xì)胞真核微生物，以芽殖或裂殖方式進(jìn)行無(wú)性繁殖，也可通過(guò)形成子囊孢子進(jìn)行有性繁殖[1]。酵母菌對(duì)環(huán)境的耐受性較強(qiáng)，可在低溫、低濕、低pH值、高鹽度及高糖度等多數(shù)細(xì)菌無(wú)法生長(zhǎng)的環(huán)境中生存，因此其廣泛分布于各生態(tài)位，與人類生活息息相關(guān)。食品的特性和加工貯藏的條件可抑制細(xì)菌的快速生長(zhǎng)和競(jìng)爭(zhēng)力，同時(shí)軟飲料自身較低的pH值（通常在2.6～4.0）可抑制大多數(shù)細(xì)菌及病原菌的生長(zhǎng)。因此，在高酸性和/或高糖度條件下，酵母菌是食品及工業(yè)飲料中普遍存在的腐敗微生物源。雖然腐敗酵母菌在已知酵母類群中僅占很小的比例，但其會(huì)引起食品感官評(píng)價(jià)降低，進(jìn)而引起食品腐敗等一系列安全問(wèn)題[2-3]。食品的腐敗變質(zhì)會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，在新型產(chǎn)品研發(fā)和生產(chǎn)中防止腐敗是食品科學(xué)工作者最關(guān)注的一個(gè)問(wèn)題[4-6]。

微生物的生長(zhǎng)是導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)的根本原因，腐敗酵母菌的生長(zhǎng)不僅可改變飲料風(fēng)味，產(chǎn)生渾濁、沉淀物或絮凝物等腐敗變質(zhì)現(xiàn)象，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致包裝膨脹甚至爆炸[7-8]。食品防腐劑作為食品添加劑的一個(gè)類別，可通過(guò)干擾微生物的遺傳物質(zhì)及功能蛋白的正常運(yùn)作抑制微生物的生長(zhǎng)，從而達(dá)到延長(zhǎng)食品保鮮期和保質(zhì)期的目的[9]。食品防腐劑的應(yīng)用已成為食品產(chǎn)業(yè)鏈的常態(tài)，與人們的日常生活密不可分。在食品中添加合適的防腐劑既可以保證食品的風(fēng)味又能保證食品安全。不同微生物的致腐能力和特征不同，為研究飲料腐敗變質(zhì)的原因，本研究對(duì)出現(xiàn)脹瓶的飲料中的腐敗酵母菌進(jìn)行了分離、純化、鑒定，確定腐敗菌的微生物種類，并以其為供試菌，研究了生產(chǎn)中常用防腐劑對(duì)其控制效果，以期為飲料腐敗菌的控制及防腐劑的選擇、添加提供理論參考數(shù)據(jù)，從而有效解決其在貯藏過(guò)程中因微生物變敗脹罐問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)食品生產(chǎn)安全高效、低成本。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山梨酸鉀、苯甲酸鈉（食品級(jí)），上海阿拉丁試劑有限公司；孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；核酸提取試劑及PCR試劑，Takara Bio公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；生化培養(yǎng)箱，天津泰斯特儀器有限公司；數(shù)顯干燥箱，天津泰斯特儀器有限公司；電子天平，賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；移液器，德國(guó)Eppendorf；PCR儀，美國(guó)ABI；DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠；全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株分離與純化

采用梯度稀釋法用無(wú)菌生理鹽水對(duì)脹瓶樣品進(jìn)行10倍遞增系列梯度稀釋，各稀釋度分別取1 mL樣品勻液于2個(gè)無(wú)菌平皿內(nèi)，加入25 mL 45 ℃孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基，混合均勻。同時(shí)，分別取1 mL無(wú)菌稀釋液勻液于2個(gè)無(wú)菌平皿內(nèi)作為空白對(duì)照。待培養(yǎng)基完全凝固后置于28 ℃培養(yǎng)2～5 d。取典型菌落編號(hào)為KS01并在分離培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線純化。

1.3.2 菌種鑒定

形態(tài)特征及理化實(shí)驗(yàn)鑒定參考《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》進(jìn)行鑒定[10]。同時(shí)，采用通用引物NL1-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG和NL4-GGTCCGTGTTTCAAGACGG，擴(kuò)增26S rRNA序列。PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃1 min，退火52 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 80 s，共35個(gè)循環(huán)；再延伸72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至北京華大基因科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.3.3 不同防腐劑對(duì)酵母菌的控制研究

參考《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）[11]中規(guī)定的添加量，分別配制含0 g·kg-1、0.05 g·kg-1、0.10 g·kg-1和 0.15 g·kg-1（4 個(gè)濃度組）苯甲酸鈉及山梨酸鉀的樣品；同時(shí)，用生理鹽水將活化后的酵母菌菌株進(jìn)行梯度稀釋，制得菌懸液備用。無(wú)菌條件下，在含有不同濃度的苯甲酸鈉和山梨酸鉀的樣品中加入酵母菌菌懸液，使酵母菌的初始濃度為1.5×103CFU·mL-1。每組樣品3個(gè)平行，混勻后于28 ℃靜置，在第0天、第3天、第7天和第28天分別進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。以生理鹽水為空白對(duì)照。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

應(yīng)用BLAST程序?qū)λ@得的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性比較，并利用Clustal X及MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；應(yīng)用Graph Pad 5.0進(jìn)行進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及正交實(shí)驗(yàn)方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的分離結(jié)果及形態(tài)特征

如圖1A所示，KS01菌落在PDA培養(yǎng)基上呈乳白色，周圍光滑，圓形，中央微隆起，邊緣整齊，有明顯光澤。菌落直徑3～4 mm，黏稠，易于挑取，有芳香味。如圖1B所示，其細(xì)胞呈卵圓形，大小為（3.0 ～ 7.5） μm×（1.5 ～ 3.0） μm（長(zhǎng) × 寬）。

圖1 KS01菌落形態(tài)及細(xì)胞特征

2.2 酵母菌的鑒定結(jié)果

菌株KS01經(jīng)NL1/NL4引物擴(kuò)增所得26S rDNA序列長(zhǎng)度大小為587 bp。利用BLAST軟件將該序列在NCBI中已有的序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株KS01與多株異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）的26S rDNA序列的同源性均在100%。利用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育圖（圖2），明確KS01與相關(guān)酵母菌之間的親緣關(guān)系。結(jié)合形態(tài)鑒定結(jié)果和同源性比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果，可認(rèn)定菌株KS01為異常威克漢姆酵母（W. anomalus）。

圖2 菌株KS01系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 常見防腐劑對(duì)酵母菌的控制研究

2.3.1 苯甲酸鈉對(duì)酵母菌的控制研究

不同濃度的苯甲酸鈉對(duì)異常威克漢姆酵母菌KS01的控制效果如圖3所示。苯甲酸鈉對(duì)KS01的抑制效果與處理濃度及時(shí)間呈正相關(guān)，相同處理時(shí)間點(diǎn)，樣品中酵母菌菌體量隨苯甲酸鈉濃度的增加而呈逐漸下降趨勢(shì)；含相同濃度苯甲酸鈉的樣本中酵母菌菌體量隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)逐降低的趨勢(shì)。因此，不同處理濃度的苯甲酸鈉從處理第3天開始均對(duì)異常威克漢姆酵母具有顯著且持續(xù)的抑制效果（P＜ 0.001）。

圖3 苯甲酸鈉對(duì)KS01的控制效果

2.3.2 山梨酸鉀對(duì)酵母菌的控制研究

不同濃度的山梨酸鉀對(duì)異常威克漢姆酵母菌KS01的控制效果如圖4所示。山梨酸鉀對(duì)異常威克漢姆酵母控制效果極顯著（P＜0.01），其對(duì)異常威克漢姆酵母控制效果與處理濃度及時(shí)間呈正相關(guān)。處理3 d后，0.05 g·L-1山梨酸鉀對(duì)KS01的控制效果極顯著（P＜0.01），且隨山梨酸鉀濃度的增加，控制效果逐漸增強(qiáng)（P＜0.001）。同一處理時(shí)間，樣品中酵母菌菌體量隨山梨酸鉀濃度的增加而呈下降趨勢(shì)；同一處理濃度中，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品中酵母菌菌體含量呈降低的趨勢(shì)，靜置28 d后，菌體含量不足20 CFU·mL-1，說(shuō)明苯甲酸鈉對(duì)異常威克漢姆酵母具有顯著、持續(xù)的抑制效果。本研究中采用的兩種防腐劑相比，山梨酸鉀更安全，可保持食品原有的產(chǎn)品穩(wěn)定性，可作為抑制異常威克漢姆酵母污染的首選防腐劑。

圖4 山梨酸鉀對(duì)KS01的控制效果

3 討論

食品加工、貯運(yùn)過(guò)程中由微生物引起的腐敗變質(zhì)一直是食品保鮮領(lǐng)域面臨的世界性難題[12]。防腐劑可通過(guò)有效抑制食品中微生物的生長(zhǎng)、繁殖，提升食品保存性，最終達(dá)到延長(zhǎng)保存期和貨架期的目的[13]。但隨著食品工業(yè)的快速發(fā)展，傳統(tǒng)的食品防腐劑已無(wú)法滿足生產(chǎn)需求，因此選擇有效、操作簡(jiǎn)便、低成本的防腐劑成為食品生產(chǎn)企業(yè)急需解決的關(guān)鍵問(wèn)題。異常威克漢姆酵母（W. anomalus）屬畢赤酵母，是食品生產(chǎn)各環(huán)節(jié)中普遍存在的酵母菌，也是飲料生產(chǎn)中常見的一種引起腐敗的酵母菌[14-16]。郭冬琴等[6]從滅菌后脹瓶的橙汁中分離得到W. anomalus，與本研究所得結(jié)果一致。陸文俊等[17]也從蜂蜜中分離得到2株異常威克漢姆酵母，是蜂蜜中主要的腐敗酵母菌，且具有較強(qiáng)的腐敗能力。也有研究表明，畢赤酵母屬也是導(dǎo)致葡萄酒和米酒發(fā)酵異常的原因之一[18-19]。因此，微生物的生長(zhǎng)是導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)的根本原因，且不同微生物的致腐能力和特征不同。根據(jù)酵母菌的發(fā)生率和變質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)，可將食品飲料生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)的酵母菌劃分為3個(gè)類別，異常威克漢姆酵母屬于軟飲料工廠生產(chǎn)中常見的第2類腐敗酵母菌[20-21]。

防腐劑是食品生產(chǎn)過(guò)程中必不可少的添加劑。目前，我國(guó)使用的防腐劑主要是化學(xué)類食品防腐劑，其中酸性防腐劑如苯甲酸、山梨酸對(duì)酵母菌、霉菌及多數(shù)腐敗菌均有抑制效果。已有的研究表明，苯甲酸鈉主要通過(guò)干擾細(xì)胞代謝相關(guān)的酶活性抑制微生物細(xì)胞三羧酸循環(huán)，影響細(xì)胞代謝，阻礙細(xì)胞膜的通透性；而山梨酸鉀主要通過(guò)與巰基結(jié)合干擾細(xì)胞內(nèi)多種酶系統(tǒng)，從而達(dá)到抑制微生物生長(zhǎng)的目的[4]。二者都屬于酸性防腐劑，在酸性環(huán)境下對(duì)微生物的抑制效果顯著，這與本研究中產(chǎn)品性質(zhì)一致，因此苯甲酸鈉和山梨酸鉀對(duì)異常威克漢姆酵母具有明顯持續(xù)的抑制效果。苯甲酸鈉和山梨酸鉀屬于酸性防腐劑，其抑菌效果主要取決于它們未解離的酸分子，抑菌效果隨pH而定，酸性越大效果越好，而在堿性環(huán)境中幾乎無(wú)效[22]。相同pH值下，苯甲酸的未解離度僅為山梨酸的1/3，其抑菌效力亦僅為山梨酸的1/3，因此山梨酸鉀防腐效果比苯甲酸鈉好[23]。此外，苯甲酸及其鈉鹽有疊加中毒現(xiàn)象，而山梨酸及其鹽類抗菌力強(qiáng)，毒性小，是目前國(guó)際上公認(rèn)的最好防腐劑，已被所有國(guó)家和地區(qū)允許使用[24]。另有研究表明飲料中富含氧氣可促使異常威克漢姆酵母增殖，最終導(dǎo)致產(chǎn)品腐敗[8,25]。因此，應(yīng)及時(shí)對(duì)生產(chǎn)設(shè)備和產(chǎn)品進(jìn)行酵母菌監(jiān)測(cè)，從全方位確保產(chǎn)品質(zhì)量。為不斷提升產(chǎn)品的品質(zhì)和安全性，天然防腐劑的選擇和復(fù)配研究工作將是后續(xù)研究工作的重點(diǎn)。

4 結(jié)論

從腐敗飲料樣本中分離獲得一株乳白色酵母菌，將其命名為KS01。根據(jù)其菌落形態(tài)、細(xì)胞特征及26S rDNA序列分析結(jié)果，認(rèn)定菌株KS01為異常威克漢姆酵母（W. anomalus）。因此，在新型飲料產(chǎn)品（如具有酸性、富氧、含糖等特征的飲料）的研發(fā)工作中需謹(jǐn)防因異常威克漢姆酵母污染導(dǎo)致的產(chǎn)品腐敗變質(zhì)。同時(shí)，污染酵母菌的控制研究結(jié)果表明，低劑量山梨酸鉀和苯甲酸鈉均對(duì)異常威克漢姆酵母具有顯著且持續(xù)的抑制效果（P＜0.01）。其中，山梨酸鉀在保持食品原有的產(chǎn)品穩(wěn)定性的同時(shí)更安全，可作為抑制異常威克漢姆酵母污染的首選防腐劑，符合食品防腐劑應(yīng)具有的低濃度下防腐效果好、性質(zhì)穩(wěn)定、成本低廉等特點(diǎn)，為防腐劑的選擇和添加提供參考。